苯酰菌胺原药和水分散粒剂的高效液相色谱分析方法研究

陈慧萍，孟 璨，马杜康，赵鹏跃，黄啟良

（中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）

苯酰菌胺是一种苯甲酰胺类杀菌剂，由罗门哈斯公司（现为陶氏农业科学公司）研发，兼具保护和治疗作用。原药为白色精细粉末，具有类似甘草的气味。熔点为159.5～161℃；蒸气压小于1×10-2mPa（小于或等于45℃）；分配系数：KowlgP值为3.76（20℃）；相对密度为1.38（20℃）。溶解度：在水中溶解度为0.681 mg/L（20℃）；在丙酮中溶解度为55.7 g/L（25℃）。水溶液中水解DT50约为15 d（pH为4和7）、8 d（pH为9）[1]。苯酰菌胺可有效防治由卵菌纲真菌引起的病害，对葡萄霜霉病有特效，对部分子囊菌和担子菌病害也有较好的生物活性[2]。

目前，关于苯酰菌胺分析方法的报道较少。有文献报道用气相色谱-质谱法检测葡萄中苯酰菌胺含量的方法[3]。张春荣等[4]报道了用气相色谱分析黄瓜及土壤中苯酰菌胺含量的方法。李皓[5]利用气相色谱-质谱法检测了香椿等芽菜类蔬菜中苯酰菌胺的含量。迟梦宇等[6]建立了一种液相色谱-质谱法测定梨中苯酰菌胺含量的分析方法。然而，苯酰菌胺农药产品的检测方法尚无报道，其原药及制剂中有效成分含量的测定尚无标准方法。笔者建立了在同一液相条件下测定苯酰菌胺原药和水分散粒剂的方法，为苯酰菌胺农药制剂产品质量检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260-DAD高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司公司；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18不锈钢柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、KQ3200B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；有机过滤器（微膜孔径为0.45 μm）。

乙腈（色谱纯）、二次蒸馏水、苯酰菌胺标准品（质量分数99.7%），First Standard公司；96%苯酰菌胺原药、75%锰锌·苯酰菌胺水分散粒剂，市场购买获得。

1.2 液相色谱操作条件

流动相：乙腈＋水（体积比为65∶35）；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm进样体积：5 μL；保留时间：苯酰菌胺约10.4 min。

上述液相色谱操作条件是典型的操作参数，可以根据不同仪器特点和温度条件，对给定的操作参数进行适当的调整，以获得最佳效果。典型的苯酰菌胺标准品、96%苯酰菌胺原药、75%锰锌·苯酰菌胺水分散粒剂样品高效液相色谱图见图1、2、3。

图1 苯酰菌胺标准品高效液相色谱图

图2 96%苯酰菌胺原药高效液相色谱图

图3 75%锰锌·苯酰菌胺水分散粒剂高效液相色谱图

1.3 测定步骤

1.3.1 标准样品的配制

称取含0.10 g（精确至0.000 01 g）苯酰菌胺标样于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇，超声波振荡10 min，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀。用移液管移取10 mL上述溶液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤。

1.3.2 试样溶液的配制

称取含0.10 g（精确至0.000 01 g）苯酰菌胺的试样于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇，超声波振荡15 min，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀。用移液管取10 mL上述溶液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤。

1.3.3 测定

在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针苯酰菌胺峰面积相对变化小于1.2%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

1.3.4 计算

将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中苯酰菌胺的峰面积分别进行平均。试样中苯酰菌胺质量分数按公式（1）计算。

式中：w为试样中苯酰菌胺质量分数，%；A2为试样溶液中苯酰菌胺峰面积的平均值，mAU·s；m1为苯酰菌胺标样的质量，g；P为标样中苯酰菌胺质量分数，%；A1为标样溶液中苯酰菌胺峰面积的平均值，mAU·s；m2为试样的质量，g。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

根据苯酰菌胺物化性质，选择甲醇作为溶剂溶解样品，并以乙腈和水作为流动相。将流动相按不同比例在色谱柱上进行试验，随着乙腈比例的增加，保留时间减小，当乙腈与水比例达到70∶30时，有杂质峰干扰苯酰菌胺，峰纯度达不到试验要求，最终选择乙腈＋水体积比为65∶35作为流动相，流速1.0 mL/min。该条件下，苯酰菌胺色谱峰峰形较好，与杂质能完全分离，具有良好的精密度和准确度，并且分析时间较短，提高了工作效率。

2.2 检测波长的选择

利用紫外-可见检测器对苯酰菌胺溶液在210～400 nm范围内进行扫描。苯酰菌胺的紫外光谱图如图4所示，从图中可以看到苯酰菌胺的最大吸收波长约210 nm，但在该波长处有干扰，而吸收波长在约240 nm处为次高峰，故将检测波长确定为240 nm。

图4 苯酰菌胺紫外吸收谱图

2.3 分析方法的特异性

本试验采用HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别苯酰菌胺。苯酰菌胺标样、96%苯酰菌胺原药、75%锰锌·苯酰菌胺水分散粒剂中的苯酰菌胺HPLC-DAD峰纯度均大于990，有效成分处无其他物质干扰，符合定量分析要求。

2.4 分析方法的线性关系

按1.3.1标准样品的配制方法配制标样溶液，用甲醇以1∶1的比例梯度稀释4次，获得5个浓度的有效成分线性相关溶液。在上述操作条件下，待仪器稳定后，按照分别进同样体积的标样，进行测定，取2次测定的平均结果。以苯酰菌胺质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。从图5可以看出，当苯酰菌胺质量浓度在100.07 mg/L～1 601.18 mg/L（进样体积5 μL），与相应的苯酰菌胺峰面积之间呈现良好的线性关系，计算得回归方程为y=8.296 8 x＋51.66，相关系R2=1.000 0，完全可以满足定量分析要求。

图5 苯酰菌胺标准曲线

2.5 分析方法的精密度

从同一样品中称取5个试样，在上述色谱条件下进行分析，测得96%苯酰菌胺原药和75%锰锌·苯酰菌胺水分散粒剂的标准偏差分别为0.15%和0.03%（表1）。

表1 苯酰菌胺水分散粒剂分析方法的精密度试验结果

96%苯酰菌胺原药中苯酰菌胺质量分数测定结果的变异系数为0.16，小于修改的Horwitz公式的计算值（2（1-0.51ogC）×0.67=1.35，其中C为样品中有效成分质量分数的平均值），表明有效成分分析方法精密度的测定结果符合要求。

75%锰锌·苯酰菌胺水分散粒剂中苯酰菌胺质量分数测定结果的变异系数为0.34，小于修改的Horwitz公式的计算值（2（1-0.51ogC）×0.67=1.96），表明有效成分分析方法精密度的测定结果符合要求。

2.6 水分散粒剂分析方法的准确度

分别称取5个已知含量的75%锰锌·苯酰菌胺水分散粒剂试样于50 mL容量瓶中，加入2.4中配制的1 601.18 mg/L苯酰菌胺标样溶液5 mL，用甲醇超声溶解，冷却至室温，再用甲醇定容至刻度，摇匀。苯酰菌胺的回收率按式（2）计算。

式中：R为回收率，%；a为测定量，mg；b为所称样品中待测组分量，mg；c为理论加入量，mg。

经测定，75%锰锌·苯酰菌胺水分散粒剂中有效成分苯酰菌胺的回收率为101.50%，结果见表2，表明有效成分分析方法准确度的测定结果符合要求。

表2 苯酰菌胺水分散粒剂分析方法的准确度试验结果

3 结 论

利用高效液相色谱对96%苯酰菌胺原药和75%锰锌·苯酰菌胺水分散粒剂中的苯酰菌胺进行了定性定量分析。实验结果表明，该方法分离效果好、准确度和精密度高、线性关系良好，并且操作简便、快速，可以进行苯酰菌胺原药及制剂产品的有效成分分析。