UPLC-Q-Orbitrap HRMS测定白酒接触塑料制品中21种双酚类及其衍生物

刘 松，赵振宇，曾稳稳，聂 叶，王和玉

(贵州茅台酒股份有限公司，贵州仁怀 564501)

双酚类化合物及其衍生物(Bisphenols，BPs)是一类结构相似(具有两个羟苯基)的物质，主要包括双酚A(Bisphenol A，BPA)、双酚S(Bisphenol S，BPS)、双酚A二缩水甘油醚(Bisphenlo A-diglycidyl，BADGE)、双酚F二缩水甘油醚(BFDGE)和四氯双酚A(Tetrachlorobisphenol A，TCBPA)等[1-2]。它们常可作为环氧酚醛内涂料、聚氯乙烯有机溶胶内涂料等食品接触塑料材料的初始原料、热稳定剂和增强剂[3]。由于BPA具有内分泌干扰性、拟雌激素活性和致癌效应[4-6]，国内外出台了一系列的控制法规，欧盟、美国等率先对食品接触材料中BPA的迁移进行了严格限制[7-8]，国家标准GB9685-2016规定BPA的迁移限量为0.6 mg/kg[9]。虽然一些与BPA结构和性能相似的BPS、BPF、BFDGE等逐渐代替了BPA在实际生产中使用，但已有研究证明，该类双酚类物质同样存在潜在危害，并且更易富集，在环境中不易降解[10-11]。在白酒生产过程中，输酒管道密封垫和瓶盖等物资常采用塑料制品，白酒与之接触过程中，就可能将塑料制品中的双酚类及其衍生物带入酒中，产生食品安全风险问题。因此，开发白酒接触塑料中双酚类及其衍生物化合物的检测方法对防范白酒的食品安全事件的发生具有重要的意义。

目前，测定双酚类及其衍生物化合物的方法主要有液相色谱法[12-13]、液相色谱-质谱法[14-16]、气相色谱法[17]、气相色谱-质谱法[18]、酶联免疫吸附测定法[19]、毛细管电泳法[20]、生物传感器法[21]等。双酚类及其衍生物化合物含有酚羟基，属于中等极性，沸点较高，适合HPLC分析[22]，但HPLC法灵敏度较低，仅依据保留时间定性，可能出现假阳性[23-24]；液相色谱-质谱法灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强，是目前该类化合物最常用的检测方法[1]。但关于酒类产品中双酚类及其衍生物的检测方法鲜有报道，白酒在生产过程中接触到塑料制品的种类较多，导致可能迁移进入白酒中双酚类及其衍生物化合物的种类较多。因而需要建立一种覆盖范围广的多种双酚类及其衍生物化合物的快速测定方法，完善白酒产业链食品安全研究，保障白酒的食品安全。

本研究利用超高效液相色谱/四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法(UPLC-Q/Orbitrap HRMS)快速筛查测定白酒接触塑料中21种双酚类及其衍生物，以建立一种种类覆盖范围广、快速、准确的同时测定方法，降低假阳性检出率，为白酒接触塑料制品中双酚类及其衍生物的定性、定量分析提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白酒接触塑料制品 贵州茅台提供；双酚A(BPA)、双酚B(BPB)、双酚C(BPC)、双酚F(BPF)、双酚S(BPS)、双酚Z(BPZ)、双酚AF(BPAF)、双酚AP(BPAP)、双酚P(BPP)、4,4-磺酰 二(2-甲 基 苯 酚)(DMBPS)、四 氯 双 酚A(Tetrachlorobisphenol A，TCBPA)、四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBPA)、双酚A二缩水甘油醚(Bisphenlo A-diglycidyl，BADGE)、双酚A-(2-3-二羟基丙基)甘油醚(BADGE-H2O)、双酚A-(2-3-二羟基丙基)醚(BADGE-2H2O)、双酚A-(3-氯-2羟丙基)甘油醚(BADGE-HCl)、双酚A-(3-氯-2羟丙基)醚(BADGE-2HCl)、双酚A-(3-氯-2羟丙基)(2-3-二羟基丙基)醚(BADGE-H2O-HCl)、双酚F二缩水甘油醚(BFDGE)、双酚F-(2-3-二羟基丙基醚)(BFDGE-2H2O)、双酚F-(3-氯-2羟丙基)醚(BFDGE-2HCl)21种双酚类及其衍生物标准品 纯度≥99%，德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇 LCMS级，默克公司；无水乙醇 HPLC级，美国天地公司；0.22 μm微孔滤膜 Agilent公司。

Q-Exactive四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪 Thermo公司；XP205电子天平 梅特勒公司；MILLI-Q纯水仪 密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 迁移试验：参照GB 5009.156-2016《食品安全国家标准 食品接触材料及制品迁移试验预处理方法通则》选择迁移量测定要求和结果表述要求，按照GB 31604.1-2015《食品安全国家标准 食品接触材料及制品迁移试验通则》，选择合理的食品模拟液和迁移条件，最终迁移试验食品模拟液采用体积分数50%和95%的乙醇水溶液。

迁移液的处理：采用甲醇稀释10倍，超出标准曲线范围的可以进一步用甲醇稀释，过0.22 μm的滤膜后分析。

1.2.2 标准溶液的配制 分别准确称取21种双酚类及其衍生物标准品0.0500 g用甲醇溶解，并定容至50 mL棕色容量瓶中，振荡均匀即得浓度为1000 mg/L的标准储备液，存于4 ℃冰箱中保存备用。取空白白酒接触塑料样品，按照1.2.1项处理，得到空白白酒接触材料基质提取液，分别取21种双酚类及其衍生物储备液，空白白酒接触材料基质提取液稀释，得到21种双酚类及其衍生物浓度依次为2.5、5、10、25、50、100、250、500 μg/L的混合标准工作溶液。

1.2.3 仪器条件 色谱条件：色谱柱：Eclipse XDBC18(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)；柱温：40 ℃；进样量：1 μL；流速：300 μL/min；流动相：A为5 mmol/L的乙酸铵水溶液，B为甲醇；梯度洗脱条件：0～2 min，30%B，2～8 min，60%B，8～13 min，90%B，13～17 min，90%B，17～18 min，30%B，18～20 min，30%B，整个分析流程共20 min。

质谱条件：质谱采用加热HESI源，毛细管电压：± 3.7 kV；毛细管温度：200 ℃；鞘气：40 Arb(1 Arb ≈0.3 L/min)；辅助气：15 Arb；吹扫气：0 Arb；离子传输管温度：350 ℃；Full MS/ddMS2扫描模式；扫描范围：150～600 m/z，正负离子同时采集；一级质谱分辨率为70000，二级质谱分辨率为17500；归一化碰撞能量(NCE)30、45和60 eV。

1.3 数据处理

采用仪器自带数据分析软件Xcalibur 4.2开展数据采集和质谱图分析工作，Mass Frontier 7.0软件开展裂解规律研究。

2 结果与分析

2.1 迁移液前处理方法优化

迁移液中乙醇体积分数50%，塑料加工助剂和相关化合物含量较多，基质效应较大，样品前处理方面，为避免样品前处理过程中带来外来污染物，利用仪器高灵敏度和分辨率的特性，采用甲醇稀释的方式降低基质效应，结果如图1所示，而当稀释倍数为5倍、2倍时，BPA回收率随着目标物浓度的增加而变大，2倍时回收率可达到349.6%，当10倍时，迁移液基质对21种目标物的影响较小，具有较好的回收率。

图1 不同稀释倍数对BPA回收率影响Fig.1 Effects of different dilution times on the recovery of BPA

2.2 质谱条件优化

分别将浓度为500 μg/L的双酚类及其衍生物化合物单一标准工作液通过蠕动泵，8 μL/min流速直接注入质谱进行全扫描分析，在正离子/负离子模式下，依据目标物的理论精确质量数，找到目标物的准分子离子峰[M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+、[M-H]-等，12种双酚类化合物在负离子模式下响应较正离子模式高，宜采用负离子扫描模式。负离子模式下，双酚类化合物的酚羟基中失去一个H，形成[M-H]-准分子离子峰，精确质量数见表1。9种双酚类衍生物负离子模式下响应较正离子模式低，宜采用正离子扫描模式，[M+NH4]+峰响应强度大于[M+H]+峰，所以选择准分子离子峰为[M + NH4]+峰，精确质量数见表1。以目标物准分子离子峰的精确质量数为依据，采用Full MS/ddMS2扫描模式，优化碰撞能量，优化目标物的定性离子丰度，采用归一化碰撞能量(NCE)30、45和60 eV时，目标物定性离子丰度高，定性离子信息见表1，在数据处理过程中，依据高分辨质谱特性，定量离子为一级质谱母离子，子离子为定性离子。双酚类化合物在裂解过程中，形成[M -O - H]-的定性离子和两苯环中间C连接处发生断裂形成定性离子，以BPA为例，得到主要离子碎片为：[M-H-O]-m/z 211.0769和[M-H-C6H6O]-m/z 133.0647。双酚类衍生物在裂解过程中，易形成两苯环中间C连接处发生断裂形成定性离子，以BADGE为例，得到主要离子碎片为：m/z 135.0809和m/z 191.1074，裂解路径见图2。

表1 21种目标物的精确质量数、电离模式、保留时间、定性离子Table 1 Exact mass number, ionization mode, retention time and qualitative ions of 21 target species

图2 BADGE裂解图Fig.2 Mass fragment of BADGE

2.3 色谱条件优化

双酚类及其衍生物化合物属于中等极性化合物，可采用C18柱进行色谱分离。比较了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液3种流动相对目标化合物离子化程度的影响。结果显示，甲醇-水溶液体系时双酚类衍生物化合物的峰型及灵敏度优于乙腈-水体系，可能是甲醇为质子给体溶剂，有利于双酚类衍生物化合物电离成正离子[25]，同时发现，在甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液体系中，由于铵离子的存在，有助于消除钠离子的干扰，更有利于双酚类衍生物化合物形成[M+NH4]+离子，同张海婧[26]、张朝晖等[27]结论相似。本文选择甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相，C18色谱柱分离21种双酚类及其衍生物化合物，目标物峰型较好，响应较高，满足目标物的分析要求，以目标物的准分子离子精确质量数提取色谱图见图3。

图3 21种双酚及双酚衍生物提取离子流色谱图Fig.3 Extracted ion current chromatograms of 21 bisphenol and bisphenol diglycidyl ethers

2.4 方法学考察

2.4.1 方法的线性范围和检出限 对21种目标化合物质量浓度在2.5～500.0 μg/L之间的系列混合标准溶液进行测定，以目标组分的峰面积y对相应质量浓度x(μg/L)绘制标准曲线，其相关系数均大于0.9965。以信噪比(S/N)为3作为仪器方法的检出限(LOD)，S/N为10作为仪器方法的定量限(LOQ)，根据样品前处理过程，计算方法的定量限，其线性方程、相关系数、仪器检出限和方法定量限，结果见表2，仪器检出限在0.18～1.09 μg/L之间，方法定量限在6.0～36.3 μg/L之间。

表2 21种目标物的线性关系、仪器检出限和方法定量限Table 2 Linear range, calibration curve, R2, LOD and LOQ of 21 compounds

2.4.2 加标回收率 对空白样品进行加标实验，分别添加3个不同质量浓度的目标分析物，每个添加水平6个平行实验，计算平均加标回收率和精密度(以相对标准偏差RSD计)，结果见表3。目标分析物的回收率为82.3%～106.4%，RSD为0.7%～5.2%。

表3 21种目标物的加标回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 21 compounds（n=6）

续表 3

2.4.3 基质效应评价 液相色谱-电喷雾质谱法中，目标物的电离受溶剂环境、离子源结构和其他物质的影响较大，尽管迁移液样品基质较为简单并做了稀释处理，但在研究中仍发现迁移液中基质对目标物的测定有影响[28]，例如回收率和稳定性等，因此在21种目标物的测定方法中开展基质效应研究是有必要的，本实验采用外标法定量，基质效应(ME)采用空白样品提取液配制标准液的标准曲线斜率(Slopea)与纯溶剂配制标准溶液的标准曲线斜率(Slopeb)之比进行评价，即ME=(Slopea/Slopeb)×100。ME>100%，表现为基质增强作用，ME<100%，表现为基质抑制作用，当ME为80%～120%时表示轻微的基质效应，50%～80%或120%～150%时表示中等基质效应，<50%或>150%时标示较强基质效应[29]。本实验采用3种塑料材料(PTFE密封垫圈、ABS、PTFE、HDPE、PS、AS、PVC、LDPE复合材质的整个瓶盖、HDPE过滤板)样品考察基质效应，结果表明，在三种材料中，21种目标物的基质效应为78.3%～135.4%，无较强的基质效应，其中TCBPA在复合材质的整个瓶盖中ME为78.3%，表现为中等抑制基质效应，BPF在复合材质的整个瓶盖中ME为135.4%，表现

为中等增强基质效应，其它化合物在三种材料中ME在80%～120%之间，基质效应不明显。本方法可以采用溶剂标准曲线对各目标物进行定量。

2.5 实际样品的测定

采用本方法测定了白酒生产过程中可能接触的ABS、PTFE、HDPE、PS、AS、PVC、LDPE等材质瓶盖组件、垫圈和过滤板等15种物资，未有样品检出含有这21种双酚类及其衍生物，结果详情见表4。

表4 样品的测定结果Table 4 Results of samples

3 结论

本实验建立了超高效液相色谱-高分辨质谱测定白酒接触塑料中21种双酚类及其衍生物含量的方法。该方法较已有方法覆盖范围广，测定种类测定效率高，假阳性低，21种目标化合物质量浓度在2.5～500.0 μg/L之间线性关系良好，R2均大于0.9965，方法定量限在6.0～36.3 μg/L之间，加标回收率为82.3%～106.4%，RSD为0.7%～5.2%。该方法准确快速，灵敏度高，应用于实际样品检测时重复性良好，可为白酒生产过程中此类化合物的风险监测提供技术支撑，对完善白酒产业链食品安全研究具有重要意义。