UPLC-QTOF-MS/ MS 对乌药中阿朴菲类生物碱炮制前后差异的研究

佘 波 向星亮 时庆欣 金姝娜 张丽君 宋成武 苏 超▲ 黄荣增▲

1.湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065；2.湖北中医药大学基础医学院，湖北武汉 430065

乌药为樟科山胡椒属植物乌药Lindera aggregata(Sims) Kosterm 的干燥块根[1]，气香，味微苦、辛，有清凉感。有行气止痛、温肾散寒的功效，主要用于寒凝气滞、遗尿尿频、疝气疼痛、经寒腹痛[2]。乌药中主要含有生物碱和萜类成分，其中阿朴菲类生物碱是乌药生物碱中比例最高的种类。大量研究表明阿朴菲类生物碱具有多种药理活性，包括抗肿瘤[3]、抗氧化[4]、抗血小板凝结[5]、抗炎镇痛[6]、免疫调节[7]、抗疟原虫[8]等。

《博济方》 记载炒制缓和辛散温燥之性；《卫生家宝产科备要》记载醋制引药入肝，具有增强药物引药入肝，增强药物温通血脉，行经止痛的作用；《普济方》记载酒制增强温散寒邪，行气止痛，并引药上行；《魏氏家藏方》记载盐制引药入肾，温肾散寒等[9]。中药炮制导致中药化学成分的变化，是中药药性和功效改变的基础，只有揭露炮制过程中化学成分的变化规律，才能阐明中药炮制的机制[10]。本研究利用UPLC-QTOFMS/MS 分析技术考察不同炮制方法对乌药中阿朴菲类生物碱的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters Xevo G2-XS QTOF 飞行时间质谱仪(美国Waters 公司)；ACQUITY UPLC M-Class 液相色谱系统(美国Waters 公司)；Waters ACQUITY BEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；KDC-140HR 高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；AT-201电子分析天平(d=0.01 mg，瑞士Mettler Toledo 公司)；5200H 型超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)；Milli-Q 型纯水仪(美国Millipore 公司)

1.2 材料

乌药饮片(亳州金芍堂中药饮片有限公司，批号：190101，产地：江西乐平)经湖北中医药大学生药教研室鉴定为樟科植物乌药Lindera aggregata (Sims)Kosterm 的干燥块根；isonorboldine(去甲异波尔定)(上海源叶生物科技有限公司，批号：P10M9L61140，纯度≥98.0%)；laurotetanine(六驳碱)(上海顺勃生物工程技术有限公司，批号：20200826，纯度≥98.0%)；bulbocapnine(紫堇碱)(英国Carbosynth 生物科技有限公司，批号：FB65594，纯度≥98.0%)；姜黄素(上海源叶生物科技有限公司，批号：R03D6S6966，纯度≥98.0%)；甲醇(质谱纯，Thermo Fisher 公司)；甲酸(质谱纯，德国Merck 公司)；超纯水(美国Millipore 公司)；黄酒(绍兴圣御山酒业有限公司)；食盐(湖北盐业集团有限公司)；食醋(江苏恒顺醋业股份有限公司)。

1.3 乌药的炮制

1.3.1 炒乌药 取等份乌药100 g，置于锅内，用文火炒至深黄色，取出放凉[9]，粉碎(过80 目筛)。同法重复12 次，得到12 份炒乌药。

1.3.2 醋乌药 取等份乌药100 g，加醋30 g 拌匀略闷，置锅内，用文火加热，炒至微干，取出放凉[9]，粉碎(过80 目筛)。同法重复12 次，得到12 份醋乌药。

1.3.3 酒乌药 取等份乌药100 g，加30 g 黄酒喷洒拌均，闷润至酒被吸尽，置锅内，用文火加热，炒至微干，取出放凉[9]，粉碎(过80 目筛)。同法重复12 次，得到12 份酒乌药。

1.3.4 盐乌药 取等份乌药100 g，加40 mL 5%盐水拌匀，闷润置锅内用文火炒至微黄色取出，放凉[9]，粉碎(过80 目筛)。同法重复12 次，得到12 份盐乌药。

1.4 供试品溶液的配制

分别取去甲异波尔定、六驳碱、紫堇碱对照品适量，精密称定，用甲醇配制成浓度100 ng/mL 的混合标准品溶液。乌药生品和以上炮制品粉末过80 目筛，分别取约0.1 g，精密称定，置10 mL 容量瓶中，甲醇定容，密塞，超声30 min(100 kW，50 Hz)，取溶液适量14 000 r/min 离心10 min(转子半径7 cm)后取上清液，加入姜黄素内标液(终浓度100 ng/mL)，0.22 μm微孔滤膜滤过，分析待用。

1.5 UPLC-MS/MS 检测条件

1.5.1 色谱条件 柱温40℃；流动相A 为甲醇，B 为水；梯度洗脱：0.00～15.00 min，10%～40%A；15.01～18.00 min，40%～95%A；18.01～20.00 min，95%A；20.01～22.00 min，95%～10%A；22.01～25.00 min，10%A；流速0.3 mL/min；进样量2 μL。

1.5.2 质谱条件 采用ESI 离子源，正离子模式下采集数据；MSE模式采集一级和二级质谱离子，采集范围均为：m/z100～1200 Da；电喷雾电压3000 V；锥孔电压40 V；ESI 离子源温度：100℃；脱溶剂温度500℃；气帘气50 L/h；脱溶剂气(N2)流速为600 L/h；一级碰撞能量：10 eV，二级碰撞能量：35 eV；碰撞能量波动±10 eV，以脑啡肽(m/z 556.2771)调谐液作为实时校正溶液。

1.6 数据采集与统计

采用MassLynx V4.1 对UPLC-QTOF-MS/MS 数据进行处理，结合Mass 值、参考文献中的保留时间和分子式匹配软件、对各主要分子离子峰进行归属，记录阿朴菲类生物碱和内标的峰面积。

使用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，t 检验进行差异性统计。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乌药中阿朴菲类生物碱的表征

去甲异波尔定、六驳碱、紫堇碱为3 类典型性阿朴菲类生物碱，由于骨架结构类似，均产生特征性m/z 177.0699 碎片离子。化合物3 的分子离子峰为[M+H]+为314.1420，计算出分子式为C18H19NO4，两个苯环上的取代基为-OH 和-OCH3，先脱去一个NH3，可以直接脱去CH3·和CH3O·，最后可以脱去一个CO，出现二级特征离子[M+H-NH3]+和[M+H-NH3-CH3]+，此裂解行为和保留时间与A 类的标准品去甲异波尔定一致[11]；化合物21 的分子离子峰[M+H]+为342.1690，计算出分子式为C20H23NO4，裂解规律与去甲异波尔定类似，仅在甲氧基和羟基的数目不同[12]，此裂解行为和保留时间与B 类的标准品六驳碱一致[13]；C 类的阿朴菲类生物碱，与A 和B 类的不同在于存在亚甲二氧环桥，这种结构比较特殊，化合物36 的分子量326.1389，计算出分子式为C19H19NO4，当[M+H]+脱去NH2CH3之后，形成特征的[M+H-NH2CH3-CH3]+的子离子，再结合特征子离子[M+H-NH2CH3]+[14]，此裂解行为和保留时间与C 类的标准品紫堇碱一致[15]，见图1。在乌药生品和炮制品的混合样品中，阿朴菲类生物碱化合物的轮廓谱见图2(封三)。通过以上两个主要步骤完成乌药及其炮制品中的阿朴菲类生物碱的识别和表征，最终鉴别36 种阿朴菲类生物碱化合物。见表1。

表1 乌药中36 种阿朴菲型生物碱类化合物

图1 阿朴菲类生物碱图特征性子离子

图2 基于UPLC-QTOF-MS/MS 阿朴菲类生物碱特征轮廓谱(见内文第10 页)

2.2 炮制前后乌药中阿朴菲类生物碱的变化

与生乌药比较，经炒制后，该类成分相对含量下降18 个，增加9 个；经醋制后，相对含量下降21 个，增加6 个；经酒制后，相对含量下降21 个，增加6 个；经盐制后，相对含量下降23 个，增加7 个。见图3。

图3 炮制后阿朴菲类生物碱相对含量的变化

在4 种炮制过程中，生物碱含量以降低为主，且大部分集中在A 类和C 类。有19 个化合物在4 种炮制过程中都发生明显的变化，其中A 类中有8 个，占比57%，这8 个化合物在4 种炮制过程中的含量均减少。B 类中有3 个，占比43%，化合物16 与21 的含量在4 种炮制过程均减少，而化合物19 的含量在4 种炮制过程中均上升。C 类有8 个，占比53%，化合物25在4 种炮制过程中均增加，化合物28、29、34、35、36 在4 种炮制过程均降低。化合物26 在盐制过程中基本消失殆尽，而在炒制、醋制、酒制过程中含量均显著升高；化合物32 在酒制和盐制过程中消失殆尽；化合物18 在4 种炮制过程中均没有发生明显地变化，比较稳定。

3 讨论

天然产物中同分异构体众多，乌药中阿朴菲类生物碱也有较多的同分异构体[16]，具有相同的骨架结构，所以具有共有的特征离子，结合其他的特征离子[17]，可以对乌药中阿朴菲类生物碱加以区分。中药的炮制过程对中药的影响复杂，药材中化学成分的种类、数量和比例的变化可能是其不同功能和药理作用的原因[18]。

中药炮制过程中引起组分结构发生动态变化[19]，炮制后，与生乌药比较，大部分生物碱含量变化有统计学意义(P ＜0.05)。荷叶中生物碱大部分为阿朴菲类生物碱，检验荷叶炒碳过程中升华物的成分，鉴别出5 种生物碱，经过炒碳之后，总生物碱含量下降，是生物碱升华的结果[20]。阿朴菲类生物碱遇热不稳定，容易升华降解，而乌药的4 种炮制过程都经过炒制，推测可能在炮制过程中升华，导致生物碱含量降低。同时有研究显示厚朴经炮制后，厚朴中的阿朴菲类生物碱和苄基异喹啉类生物碱含量均显著下降[21]。炒乌药缓和辛散温燥之性，可能与其中生物碱含量的下降有关。阿朴菲类生物碱的毒性与亚甲二氧环桥及N-甲基的取代有关[22]，阿朴菲类生物碱对癌症细胞和正常细胞都有杀伤作用[23]。炮制之后化合物莲叶桐碱的含量下降，可明显降低细胞毒性。而少数生物碱的含量上升，可能是炮制过程中导致生物碱构型的转化，或者一些糖苷型生物碱的降解[24]。同时乌药为块根，质地坚硬，炮制后粉碎，有利于溶媒的进入，也有可能更利于有效成分生物碱的煎出[25-26]。

本研究初步阐明了乌药炮制前后阿朴菲类生物碱的变化规律，为乌药炮制工艺优化，质量标准提升提供了科学依据。