高效液相色谱法同时测定甘草总黄酮口腔贴膜中甘草查尔酮A和甘草素含量*

林晓春，李旭桂，张志勤，郑锦坤，翁立冬△

（1.广东省粤北人民医院，广东 韶关 512025； 2.南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515）

甘草总黄酮为甘草的主要有效成分，具有显著抗应激、镇痛、抗炎、抗自由基损伤、调节免疫功能、促进上皮细胞增殖、修复黏膜完整性等多种生物活性作用［1－5］。前期研究中以其为主药制备了甘草总黄酮双层缓释口腔贴膜，所得贴膜生物性能良好［6］，并具有良好的抗炎、镇痛、促进黏膜完整性修复的作用，但尚不明确其主要成分和质控指标。甘草总黄酮的成分包含水溶性和脂溶性，化学成分有黄酮类、异黄酮类、查尔酮和二氢黄酮类，其中二氢查尔酮和查尔酮是甘草总黄酮的主要成分，且甘草查尔酮A和甘草素分别为其代表成分及活性成分。本研究中建立了同时测定甘草总黄酮口腔贴膜中甘草查尔酮A和甘草素含量的高效液相色谱法，为甘草总黄酮口腔贴膜的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Aglient 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；BSA124S型电子天平（德国赛多利斯公司，精度为万分之一）；KQ－300ES型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为300 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

甘草查尔酮A对照品（批号为150924，含量为98.5%），甘 草 素 对 照 品（批 号 为140827，含 量 为98.8%），均购自成都克洛玛生物科技有限公司；甘草总黄酮口腔贴膜（自制，批号分别为20181213－01，20181213－02，20181213－03）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国默克公司）；磷酸（分析纯，广东光华化学厂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent HC－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）－0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min时20%A～30%A，10～30 min时30%A～45%A，30～40 min时45%A～60%A，40～50 min时60%A～90%A）；流速：1.0 mL／min；检测波长：276 nm（0～30 min），365 nm（30～50 min）；柱温：30℃；进样量：10μL。

2.2 溶液制备

取甘草查尔酮A对照品和甘草素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，置25 mL容量瓶中定容，分别制成每1 mL甲醇含甘草查尔酮A 208μg、甘草素19.2μg的对照品溶液。取甘草总黄酮口腔贴膜0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，滤过，即得供试品溶液。按样品制备方法制备不含甘草总黄酮的口腔贴膜，依法制备不含甘草总黄酮的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下3种溶液各10μL，按2.1项下色谱条件进样测定。结果供试品溶液色谱中，有2个与对照品溶液色谱相对应的色谱峰，阴性对照无干扰。详见图1。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下含甘草查尔酮A和甘草素的对照品溶液0.1，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，加甲醇定容至5.0 mL，按2.1项下色谱条件分别进样10μL，测定峰面积。以质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程，甘草查尔酮A为Y＝6 135.7X＋31.029（R2＝0.999 9，n＝6），甘草素为Y＝16 529X＋56 197（R2＝0.999 9，n＝6）。结果表明，甘草查尔酮A和甘草素的质量浓度分别在4.16～166.40μg／mL和0.384～15.360μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

检测限考察：将混合对照品溶液逐步稀释后，分别精密吸取10μL，注入高效液相色谱仪，测定，以信噪比（S／N）为3考察检测限。结果甘草查尔酮A和甘草素的检测限分别为0.13μg／mL和0.096μg／mL。

精密度试验：精密吸取甘草查尔酮A（142.0μg／mL）和甘草素（16.0μg／mL）的混合对照品溶液，过滤，吸取续滤液10μL，连续进样测定6次。结果甘草查尔酮A和甘草素的平均峰面积分别为3 999.5和1 126.7，RSD为1.11%和1.10%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取0.3 g样品，精密称定，依法制备供试品溶液，分别于0，6，12，18，24 h时进样测定峰面积，计算含量。结果甘草查尔酮A和甘草素的RSD分别为0.77%和1.72%（n＝5），表明供试品溶液24h内稳定。

重复性试验：取样品6份，依法制备供试品溶液，分别精密吸取10μL，进样测定峰面积，计算含量。结果甘草查尔酮A和甘草素的含量分别为10.225 7 mg／g和0.693 3 mg／g，RSD分别为2.02%和2.45%（n＝6），表明方法重复性好。

加样回收试验：取甘草查尔酮A对照品和甘草素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，置25.0 mL容量瓶中，配制成混合对照品溶液（含甘草查尔酮A 105.00μg／mL，甘草素6.50μg／mL），取已知含量的甘草总黄酮膜剂（含甘草查尔酮A 102.426 4μg／mL，甘草素6.9456μg／mL）0.3g，精密称定，依法制备供试品溶液，分别精密量取供试品溶液0.5，1.0，2.0 mL，置5 mL容量瓶中，精密加入1.0 mL混合对照品溶液，用甲醇定容至刻度，过滤，分别取续滤液10μL，进样测定，记录色谱峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝9）Tab.1 Results of the recovery tests（n＝9）

2.4 样品含量测定

取3批（批号分别为20181213－01，20181213－02，20181213－03）样品各0.3 g，精密称定，依法制备供试品溶液，分别精密吸取10μL进样测定，记录峰面积，并分别计算含量。结果甘草查尔酮A和甘草素的平均含量分别为102.208 3 mg／g和0.693 5 mg／g。

3 讨论

3.1 提取方法选择

甘草总黄酮的含量测定多采用超声波提取、微波提取、萃取等方法［7－10］。口腔贴膜以交联羧甲基纤维素钠、海藻酸钠（ALG）、聚乙烯醇为载药层膜材料，甘草总黄酮分散在缓释凝胶骨架中，采用超声提取方法可促使药物从骨架中充分溶解、释放，故提取方法确定为超声提取。

3.2 提取溶剂选择

考察了不同提取溶液（甲醇、乙醇、70%乙醇、水）下甘草查尔酮A和甘草素的含量，结果采用甲醇和70%乙醇为提取溶剂时甘草查尔酮A和甘草素的含量最高，结合流动相的选择，且载药膜材料的ALG、甘油、吐温为水溶性基质，70%乙醇可导致基质溶解、释放，进而干扰含量的测定，故提取溶剂确定为甲醇。

3.3 洗脱方法选择［11－12］

甘草查尔酮A为查尔酮类黄酮，甘草素为二氢黄酮类，两者极性不同，通过改变乙腈洗脱浓度，由低到高增加流动相极性，可使甘草查尔酮A和甘草素在适宜的保留时间内洗脱出来，故洗脱方法确定为梯度洗脱。

3.4 检测波长选择

甘草查尔酮A和甘草素的最大吸收波长不同，故检测波长选择0～30min时276nm、30～50min时365nm。

3.5 方法评价

本研究中建立的方法操作简便、专属性强、准确度高，可用于甘草总黄酮口腔贴膜中甘草查尔酮A和甘草素的含量测定。