60Co-γ射线辐照灭菌升降茶适用性研究

刘 菊，白明学*，张红伟，吕 鹏，高晓洁，侯 超

(1 郑州市中医院，郑州 450007；2 河南省食品药品检验所/国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，郑州 450018)

升降茶源于升降散(出自《伤寒温疫条辨》)，由大黄、姜黄、僵蚕、蝉蜕4味中药组成，具有升清降浊、散风清热之功；主治温病表里三焦大热；症见低热或未发热、干咳、少痰、咽干咽痛、倦怠乏力、胸闷、脘痞或呕恶、便溏等。升降茶制备工艺简单易行，经粉碎、制粒、干燥、分剂量包装，用热水浸泡或稍煎取汁服用，灭菌控制至关重要。60Co-γ射线灭菌穿透力强、经济、安全，且灭菌效果彻底，尤其适宜含挥发性成分药材或制剂，对药品质量影响较小，已广泛应用于中药灭菌领域[1-4]。为确定升降茶辐照灭菌最佳剂量，确保药品质量不被破坏且达到灭菌效果，保障临床用药安全有效，本研究开展60Co-γ射线灭菌适用性研究，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A液相色谱仪(日本岛津公司)；DM3000电子显微镜(德国徕卡仪器公司)；三用紫外分析仪(上海康华生化仪器制造有限公司)；GDH-9625A电热恒温鼓风干燥箱(上海塞欧试验设备有限公司)；JA2003N电子天平(上海菁海仪器设备有限公司)；AB265-5电子天平(d=0.01 mg，梅特勒-托利多仪器有限公司)；超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；DZKW-4恒温水浴锅(河南天帝电子科技有限公司)；霉菌培养箱(北京科伟永兴仪器有限公司)；CLHN恒温恒湿培养箱(天津市华北实验仪器有限公司)；电热恒湿培养箱(上海跃进医疗器械厂)。

1.2 对照品

姜黄素(批号110823-201706，含量98.7%)、芦荟大黄素(批号110795-201007，含量98.0%)、大黄酸(批号110757-201607，含量99.3%)、大黄素(批号110756-201913，含量96.0%)、大黄酚(批号110796-201922，含量99.4%)、大黄素甲醚(批号110758-201415，含量99.1%)、大黄对照药材(批号120984-201202)，均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 试药

升降茶(郑州市中医院，豫药制备字Z20200020000，批号200125)。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。胰酪大豆胨液体培养基(批号20180823)、胰酪大豆胨琼脂培养基(批号20180910)、麦康凯液体培养基(批号20180626)、RV沙门菌增菌液体培养基(批号20180915)，均购自青岛海博生物技术有限公司。沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号180518)、肠道增菌液体培养基(批号180813)、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基(批号180627)、麦康凯琼脂培养基(批号180412)、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基(批号171211)，均购自北京陆桥技术股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 分组与试验

取升降茶40盒，分成空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10盒。低、中、高剂量组分别按4、6、8 kGy剂量进行辐照灭菌。灭菌后，根据《升降茶质量标准(草案)》进行性状、鉴别(显微鉴别、薄层色谱鉴别)、检查(水分、微生物限度)、含量测定(姜黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)质量比对分析研究[5-8]。

2.2 统计学处理

2.3 质量指标分析测定

2.3.1性状

取4组供试品适量，置白纸上，目视观察色泽，鼻嗅气味，开水冲泡口尝味道。结果：灭菌前和灭菌后，4组性状均为黄棕色的药材粗粉及颗粒；气清香，味微苦。见表1。

表1 不同剂量60Co-γ射线辐照灭菌对升降茶水分、性状的影响

2.3.2水分测定

取供试品适量，按《中国药典》2015年版四部通则0832项下方法[9]测定4组供试品水分。结果：不同剂量辐照灭菌对升降茶水分无明显影响(RSD%<2)。见表1。

2.3.3显微鉴别

取4组供试品适量，研碎，过四号筛，取粉末，置显微镜下观察。结果：表皮组织表面具网格样皱缩纹理以及纹理突起形成的小尖突，有圆形毛窝，边缘黄色(炒僵蚕)。草酸钙簇晶直径20～160 μm，有的达190 μm(大黄)。空白组显微特征见图1，不同剂量辐照灭菌后，大黄草酸钙簇晶、僵蚕表皮组织特征仍清晰可见，无明显影响。

图1 升降茶(空白组)显微特征图

2.3.4薄层色谱鉴别

分别取4组供试品0.5 g，加甲醇40 ml，浸泡0.5 h，滤过，取滤液10 ml，蒸干，残渣加水20 ml使溶解，再加盐酸2 ml，水浴加热35 min，冷却，用乙醚萃取2次，每次20 ml，合并萃取液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.2 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述2种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果：不同剂量辐照后的供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点。见图2和图3。

1：大黄对照药材；2～4：空白组供试品图2 升降茶(空白组)大黄薄层色谱鉴别图

1～3：高、中、低剂量组供试品；4：大黄对照药材图3 升降茶(高、中、低剂量组)大黄薄层色谱鉴别图

2.3.5微生物限度检查

分别取4组供试品适量，按《中国药典》2015年版四部通则1105和1106项下方法[10]测定需氧菌总数、霉菌酵母菌总数，并运用SPSS 20.0(t检验)进行统计分析，比较高、中、低剂量组与空白组是否具有统计学差异；检查大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌、沙门菌。结果：当辐照剂量大于或等于6 kGy(中剂量)时，需氧菌总数、霉菌酵母菌总数与空白组比较均有统计学差异，符合《中国药典》2015年版规定，且各控制菌为阴性，说明灭菌符合规定。见表2和图4。

表2 不同剂量60Co-γ射线辐照灭菌对升降茶微生物限度的影响

图4 不同剂量60Co-γ射线辐照对升降茶需氧菌总数、霉菌酵母菌总数的影响

2.3.6姜黄素、5种蒽醌成分含量测定[11-12]

2.3.6.1 色谱条件 色谱柱Phenomenex Lune C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长为254 nm，流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液(82∶18)，流速1.0 ml/min，柱温25 ℃。

2.3.6.2 对照品溶液制备 精密称取姜黄素、5种蒽醌(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)适量，加甲醇溶解稀释制成每1 ml含420.3 μg姜黄素、31.3 μg芦荟大黄素、167.7 μg大黄酸、49.5 μg大黄素、32.7 μg大黄酚、105.9 μg大黄素甲醚的混合对照品母液。精密吸取对照品母液1 ml，加甲醇稀释至10 ml，得混合对照品溶液。

2.3.6.3 供试品溶液制备 分别取4组供试品0.25 g，加甲醇25 ml，精密称定，超声35 min，用甲醇补足重量，过滤，取滤液5 ml挥干，加10%盐酸溶液20 ml，超声水解5 min，再加三氯甲烷10 ml，置分液漏斗中，超声35 min，分取三氯甲烷层，水层再用三氯甲烷萃取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷萃取液，回收溶剂，残渣加甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.6.4 系统性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液按“2.3.6.1”项下色谱条件测定，理论板数按姜黄素峰计不低于4000，分离度大于1.5，得色谱分离图。见图5。

1：姜黄素；2：芦荟大黄素；3：大黄酸；4：大黄素；5：大黄酚；6：大黄素甲醚图5 升降茶含量测定色谱图

2.3.6.5 供试品测定 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，以外标一点法计算含量。结果：当辐照剂量为6 kGy(中剂量)时，姜黄素、总蒽醌含量稍有下降，但与空白组比较无统计学差异；当剂量增大到8 kGy(高剂量)时，姜黄素、5种蒽醌含量下降，与空白组比较有统计学差异。说明辐照剂量增加会降低主成分含量，故最佳辐照剂量为6 kGy，既杀灭微生物、灭菌完全，又保证了样品的质量稳定。见表3、表4和图6、图7。

表3 不同剂量60Co-γ射线辐照灭菌对升降茶中姜黄素含量的影响

表4 不同剂量60Co-γ射线辐照灭菌对升降茶中5种蒽醌成分含量的影响

图6 不同剂量60Co-γ 射线辐照对姜黄素含量的影响

图7 不同剂量60Co-γ 射线辐照对总蒽醌(5种蒽醌)含量的影响

3 讨论

60Co-γ射线辐照灭菌穿透力强，可以不破坏包装而杀死药品中的微生物，安全经济，耗能低，灭菌彻底，无残留，不产生感生放射性和热量，尤其适宜热敏性物料及挥发性成分的灭菌操作，因此近年来在中药饮片、中成药、中药制剂生产中应用越来越广泛[13]。但灭菌过程中普遍存在辐照剂量高、重复辐照、有效成分损失等问题。本研究对升降茶辐照剂量进行考察，旨在筛选出既保证制剂质量稳定、不破坏有效成分，又达到灭菌效果的合理剂量。

前期研究已建立升降茶中姜黄素、5种蒽醌类成分含量同步测定的方法，并已验证方法学，本研究基于此条件开展含量测定。为确保数据的灵敏度与精确性，便于统计对比分析，本研究需氧菌总数、霉菌酵母菌总数未进行两位数修约，直接采用原始数据。

原国家食品药品监督管理总局发布的《中药辐照灭菌技术指导原则》(2015年版)建议尽可能采用低剂量辐照灭菌，中药最大总体平均辐照剂量原则上不超过10 kGy；并且需要通过一定的研究工作，考察和评估辐照灭菌对中药安全性、有效性及质量稳定性的影响。因此本研究在预实验的基础上，选择4～8 kGy剂量进行研究。

升降茶经6 kGy的60Co-γ射线辐照，既杀灭微生物，灭菌符合规定，且样品性状、显微特征、薄层色谱无变化，水分无明显影响(RSD%<2)，主成分(姜黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)含量无统计学差异(P>0.05)，质量总体无明显变化。综上所述，60Co-γ辐照可用于升降茶的灭菌，最佳辐照剂量为6 kGy，保障了升降茶临床用药安全有效。