山茱萸马钱苷的提取研究

张立攀，赵梦瑶，关炳峰，蒋碧伟，王法云，王 永

(河南省商业科学研究所有限责任公司，河南 郑州 450000)

糖尿病已成为现代社会的高发病种，糖尿病的可能病因较多[1-2]，治疗较为麻烦，迫切需要人们在药和食2个领域对其进行防治[3]。经过多年的经验和临床验证，药食同源物质防治糖尿病及其并发症具有安全和疗效持久等化学药物、生化制剂不具备的优势[1]。山茱萸是我国传统中药材[4-6]，具有滋补、固精的作用，被明确记载在《本草纲目》《吴昔本草》《救荒本草》等典籍中[7-9]。现代研究表明，山茱萸具有防治糖尿病、增强免疫、延缓衰老等功效[1,6,10-11]，可用于临床治疗腰膝酸软、小便频多、体虚盗汗等症[6,12]。山茱萸在我国主要分布于中原和西南地区[1,12-14]。山茱萸在产地有悠久的直接食用历史[13]，其深加工产品也正在研发，主要有山茱萸果酒[15-16]、发酵酸乳和营养果汁[16-17]等。2018年国家卫生健康委员会发布意见函，将山茱萸批准按照药食同源物质进行试生产。马钱苷是山茱萸的重要活性成分，是一种主要以苷的形式存在的萜苷类化合物[18-19]，因含有极性官能团而易溶于水和甲醇，主要存在于果肉中，果核中则很少[7]。马钱苷具有增强免疫、防治心血管疾病、抗炎和镇静催眠等功效，具有提高抵抗力、预防治疗心血管疾病和安神等作用[20]。从山茱萸中高效提取马钱苷，在此基础上发展山茱萸深加工产业，不仅可以推动山茱萸的深度开发利用，还可以促进山茱萸种植业的发展，实现对山茱萸资源的充分利用。

文献报道的马钱苷提取方法，以热回流法[21-22]和微波法[23]为主。热回流法因为操作安全性、热能成本高等因素逐渐落后；微波法的过程温度不易稳定控制，应用潜力较小，一般仅限于试验与研究。综合目前的报道，从山茱萸中提取马钱苷的得率普遍较低，只有0.8%[23]。鉴于此，本研究采用超声波提取法，以经过软化处理的山茱萸为原料，结合高效液相法测定，以马钱苷得率为考量指标，获得山茱萸马钱苷的正交优化提取工艺，得到较高的得率，为高附加值开发山茱萸资源奠定技术基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

山茱萸采自洛阳市栾川县山区。马钱苷对照品(HPLC≥99 %)购自德思特生物公司；甲醇为色谱纯，购自美国Mreda科技有限公司；乙腈为色谱纯，购自北京Dikma科技有限公司；其他为市售分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

主要仪器设备：DZ53T型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、QJ-08B型粉碎机(上海兆申粉碎机械有限公司)、FA2004型电子天平(上海衡际科学仪器有限公司)、AL204-ICF型分析天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司]、DHG-9052A型台式电热干燥箱(上海捷呈实验仪器有限公司)、SCIENTZ-IID型超声细胞破碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、1290 Infinity Ⅱ型液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)、RE-2000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 样品预处理

山茱萸的新鲜果实被采摘下来，用水冲洗后放在-5 ℃保存1 d，然后置于50 ℃的温水中浸泡20 min，之后脱去果核；果肉置于干燥箱中于45 ℃烘制10 h，使用粉碎机将烘干的果肉磨碎，得到山茱萸干果粉。

1.4 马钱苷含量的测定

1.4.1 标准曲线的绘制 使用甲醇和水配制成80%溶液，将马钱苷对照品6.5 mg制成50 mL对照品母液。分别取1、2、4、6、8 mL对照品母液，用同样的溶剂定容至10 mL，经过滤后采用高效液相色谱法测定。得到标准方程：y=12.755x+1.935 8，R2=0.997 4。如图1所示。

1.4.2 马钱苷含量的测定 取10 mL样品处理母液于烧杯中，置于95 ℃下蒸发除去挥发物，残渣使用体积分数80%乙醇水溶液转移、定容至10 mL容量瓶中，使用0.22 μm有机滤膜过滤，在线分析。

根据以下公式计算：

w=(c×0.025)/m

(1)

w：马钱苷得率(%)；

c：测定液中马钱苷的质量浓度(mg/L)；

m：山茱萸干果粉质量(g)。

1.4.3 色谱条件 色谱柱为Luna Omega C18柱子(长度100 mm×内径2.1 mm×粒径1.6 μm)，柱温35 ℃；流动相α：100%乙腈，β：0.35%甲酸的水溶液，流速：0.32 cm3/min，检测波长242 nm，进样体积：2.5 μL。液相程序如表1所示。

表1 液相色谱条件Tab.1 The chromatographic condition

1.5 山茱萸中马钱苷超声细胞破碎提取工艺

将称量好的山茱萸干果粉置于溶剂中，按照预先设计好的提取工艺参数进行提取。所得混合物经过抽滤后，加热抽真空浓缩，剩余红色残渣用60%的乙醇转移、定容至250 mL，作为样品处理母液。

1.6 山茱萸中马钱苷超声细胞破碎提取单因素试验

1.6.1 超声功率对得率的影响 乙醇含量为60%，固液比为1∶20，试验温度为40 ℃，超声时间为20 min，超声开/关时间为5 s/5 s，提取循环次数为1次，考察超声功率为100～300 W的试验点，并且每个试验点间相差50 W对得率的影响。

1.6.2 超声时间对得率的影响 乙醇含量为60%，固液比为1∶20，试验温度为40 ℃，超声开/关时间为5 s/5 s，提取循环次数为1次，超声功率为200 W，考察超声时间分别取10～35 min，每个试验点间隔5 min对得率的影响。

1.6.3 固液比对得率的影响 乙醇含量为60%，试验温度为40 ℃，超声开/关时间为5 s/5 s，提取循环次数为1次，超声功率为200 W，超声时间为25 min，考察固液比分别取1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35时对得率的影响。

1.6.4 乙醇含量对得率的影响 试验温度为40 ℃，超声开/关时间为5 s/5 s，提取循环次数为1次，超声功率为200 W，超声时间为25 min，固液比取1∶30，考察乙醇含量为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%对得率的影响。

1.6.5 试验温度对得率的影响 乙醇含量为50%，超声开/关时间为5 s/5 s，提取循环次数为1次，超声功率为200 W，超声时间为25 min，固液比取1∶30，考察试验温度为20～70 ℃的试验点，并且每个试验点相差10 ℃对得率的影响。

1.6.6 超声开/关时间对得率的影响 乙醇含量为50%，提取循环次数为1次，超声功率为200 W，超声时间为25 min，固液比为1∶30，提取试验温度为40 ℃，考察超声开/关时间分别设为1 s/5 s、3 s/5 s、5 s/5 s、7 s/5 s、9 s/5 s对得率的影响。

1.6.7 提取循环次数对得率的影响 乙醇含量为50%，超声开/关时间为5 s/5 s，超声功率为200 W，超声时间为25 min，固液比取1∶30，提取试验温度为40 ℃，考察提取循环次数为1～4次对得率的影响。

1.7 山茱萸马钱苷超声细胞破碎提取的正交试验

在上述单因素试验分析结果的基础上，进一步优化试验：设置提取试验温度40 ℃，超声功率200 W，选取其他4个因素进行正交试验，设计因素水平表见表2。

表2 正交试验设计方案

2 结果与分析

2.1 山茱萸中马钱苷提取的单因素试验

2.1.1 超声功率对马钱苷得率的影响 如图2所示，超声功率在200 W时，得率最高；提取结果随着超声功率的提高先升高后降低；超声功率超过200 W时，由于细胞破碎程度过高，导致原本扩散较慢的其他成分分子大幅提高速率，影响了马钱苷分子本身的扩散速率，反而不利于马钱苷的提取。故选取超声功率为200 W。

2.1.2 超声时间对马钱苷得率的影响 如图3所示，在溶液没有饱和前，随着工作时间增长，溶出分子总量增加；当超声时间为25 min时，得率最好。马钱苷分子在溶剂中的溶解存在一个饱和平衡，起初随着时间的延长，进入溶剂中的马钱苷量逐渐增多，达到平衡之后马钱苷溶解量不再增加，但随着其他杂质的溶解增加，导致马钱苷的溶解平衡被打破，溶解量受到抑制，致使得率下降。故选择超声时间为25 min。

2.1.3 固液比对马钱苷得率的影响 如图4所示，当固液比为1∶30时，得到较佳得率。当固液比高于或者低于1∶30时，得率都会降低。在固液比为1∶30的基础上，继续增加溶剂用量，得率下降，是因目标分子已经基本提取完全，其他的杂质分子继续大量进入溶剂中，对马钱苷分子的溶解也产生了一定的抑制作用。故选择固液比为1∶30。

2.1.4 乙醇含量对马钱苷得率的影响 如图5所示，当乙醇含量达到50%时，得到较佳得率。可能原因是该提取溶液的极性与目的物相近，目标分子由于相似相溶原理最容易由植物细胞中扩散过来。而无论增大或者减小溶剂含量，提取溶液与目标分子彼此极性相差越来越大；同时，其他非目标物分子，如脂溶性化合物进入溶剂的量增大，影响了目的物的扩散。故选择溶剂中乙醇的含量为50%。

2.1.5 试验温度对马钱苷得率的影响 如图6所示，当试验温度为40 ℃时，得到较佳提取得率；温度低于此时，随着温度的升高，目的物在溶剂中的溶解量增加；而高于40 ℃之后，可能原糖类或其他极性接近的物质的溶出大幅增加，抑制了目的物的溶出。故选择试验温度为40 ℃。

2.1.6 超声开/关时间对马钱苷得率的影响 如图7所示，当超声开/关时间为5 s/5 s时，得率最好；增加或者降低每一次工作过程中的工作时间比例，都会降低得率；超声开/关时间逐渐增大时，工作时间长，细胞破碎厉害，马钱苷分子更加易于溶出。当超声开/关时间过大，间歇时间太短时，由于超声产生的能量会导致试验温度升高过快而来不及散热降温，导致溶剂逸失加快，所以马钱苷得率变化不大或者略微变小。故选择超声开/关时间为5 s/5 s。

2.1.7 提取循环次数对马钱苷得率的影响 如图8所示，当提取循环次数达到2次以上时，继续增加次数，提取得率变化幅度较小。综合操作与节约因素，取提取循环次数为2次。

2.2 山茱萸中马钱苷提取的正交试验

通过研究单因素对提取得率的影响，试验温度和超声功率对山茱萸马钱苷提取影响幅度较小，因此，选取超声开/关时间、超声时间、固液比、乙醇含量4个因素设计正交试验，结果如表3。

表3 正交试验结果Tab.3 Results of orthogonal test for extraction

由表3、表4可以得出结论，提取效果影响大小顺序为：超声开/关时间>固液比>乙醇含量>超声时间；超声开/关时间具有显著性，说明该因素对山茱萸中马钱苷的提取影响最大；正交优化试验得到的最优结果为A2B2C2D3，即超声开/关时间5 s/5 s、超声时间25 min、固液比1∶30、乙醇含量55%。

优化条件下的5次确证试验中得到1.513%的得率，验证结果相符性良好。

表4 正交试验方差分析Tab.4 Variance analysis of rthogonal test

3 结论与讨论

山茱萸是河南省优势地方植物资源，在洛阳、南阳市山区有广泛种植。山茱萸获批为药食同源物质，拓宽山茱萸应用范围，对促进其深加工产业发展有积极作用，继而实现三产联动，带动当地山茱萸种植业的发展。马钱苷是山茱萸所含重要成分，提取马钱苷作为组分进行添加，能够强化相应食品产品的健康功能，实现营养与健康并重。

本研究结果显示，山茱萸马钱苷得率随着超声功率的提高先升高后降低，其原因为超声功率能够同时促进马钱苷和其他活性物分子的扩散，当马钱苷分子扩散速率相对最高时得率最高；随着超声工作时间增长，马钱苷分子溶出总量增加，当达到最大溶出量后，其他杂质的溶解量仍在继续增加，导致马钱苷的饱和溶解量开始受到抑制，得率反而下降；根据极性相适原理，当固液比达最佳值时，溶剂极性适宜，马钱苷溶出量最高，增加或减小固液比，都会导致马钱苷提取得率的降低；同理，溶剂中乙醇含量影响溶剂的极性，同样影响马钱苷得率；活性物分子的扩散速率随温度变化，当马钱苷得率最高时，继续升高温度，其他杂质分子的扩散速率逐渐居上，反而导致马钱苷得率降低；超声开/关时间逐渐增大时，超声实际工作时间相对提高，马钱苷分子溶出加快，但当超声开/关时间过大时，超声产生的热量来不及散逸，导致溶剂挥发损失加快；提取次数增加到一定值以后，马钱苷的溶出不再继续增加，所以继续增加提取次数对提高得率作用不明显。

本研究以河南山茱萸为试验材料，采用超声辅助提取的方法，在单因素试验的基础上，采用正交优化试验对山茱萸马钱苷提取工艺进行了优化，结果表明，各个因素对提取得率影响大小为超声开/关时间>固液比>乙醇含量>超声时间。优化条件为超声开/关时间5 s/5 s，超声时间25 min，固液比1∶30，乙醇含量55%，提取循环次数2次，提取试验温度40 ℃，超声功率200 W。验证提取得率显示，该优化工艺的马钱苷得率可达1.513%，远高于文献报道[23]，与预期结果较为相符。

综上所述，采用超声辅助提取的方法，能够有效提高山茱萸中马钱苷得率，可为工业化提取山茱萸马钱苷及其后续产品开发提供技术理论支撑。