6-苄基腺嘌呤人工抗原的合成及鼠源多克隆抗体的制备

孟继秋，胡骁飞，王 耀，邢云瑞，曹金博，陈琳琳，孙亚宁，张改平,3

(1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002； 2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003； 3.河南农业大学，河南 郑州 450002)

6-苄基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)是第一个人工合成的广泛应用于植物生长培养基的细胞分裂素[1]，在植物体内通常以核糖加合物6-BAR的形式存在[2]，6-BA分子式为C12H11N5，6-BA与6-BAR的结构式如图1所示。6-BA难溶于水，微溶于乙醇，在酸、碱中稳定。6-BA具有抑制植物叶绿素、核酸、蛋白质的分解，并能将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能而被广泛使用于植物生长的各个环节[3]。近年来，研究发现，6-BA具有缩短豆芽生长周期、促进茎的生长和抑制生根的作用而被滥用于豆芽生产中[4]。然而大量的研究结果显示，6-BA在豆芽内不易代谢，而且商家为了牟取暴利经常过量添加导致其在豆芽中残留，人食用含有6-BA的豆芽会造成生殖系统和神经系统的损伤，还会导致性早熟[5]，甚至会引起急性中毒和诱发癌症[6]。因此，国家食品药品监督管理总局、农业农村部和国家卫生和计划生育委员会在2015年联合发布公告[7]，严禁在豆芽生产过程中使用6-BA。但在利益的驱使下，仍有不法商家在豆芽的生产过程中违法添加6-BA，毒豆芽事件频发，对食品安全造成严重威胁。

为了防止6-BA在豆芽中的违规滥用，保证食品安全，科研人员建立了多种检测6-BA的方法，主要包括高效液相色谱法(High-performance liquid chromatography,HPLC)[8-9]、高效液相色谱-串联质谱联用(HPLC-MS)[10-11]、表面增强拉曼光谱法(Surface-enhanced raman spectroscopy,SERS)[12-13]、电化学方法[14]和免疫学检测方法[15]等。HPLC和SERS具有准确性高、特异性强等特点，但存在仪器昂贵和步骤繁琐等弊端；电化学方法虽然简单快速，但其结果受环境等因素影响，波动较大。相比之下，免疫学检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点，且耗时短、效率高，适用于大批量样品的快速筛查[16]。目前，免疫学检测方法已经成功应用于2,4-D和赤霉素等植物生长调节剂的快速检测[17-18]，有关6-BA的免疫学检测方法则较少，LI等[19]用碳二亚胺法合成6-BA人工抗原并制备6-BA单克隆抗体，以此抗体建立的胶体金层析试纸检测限可达到10 μg/L。由于6-BA进入豆芽后会部分代谢成为其核糖加合物6-BAR，可能会影响到检测的结果，且由于6-BA是小分子物质，属于半抗原，不具备直接刺激机体产生抗体的能力，必须要与大分子载体蛋白偶联制备人工完全抗原。因此，采用高碘酸盐法将6-BAR与载体蛋白结合制备完全抗原，通过免疫小鼠制备出既可以检测豆芽中已经代谢的6-BAR又可以检测生产豆芽用水中未被代谢的6-BA多克隆抗体，并对多克隆抗体进行特性鉴定，为建立6-BA的ELISA快速检测方法奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与溶液 6-BA、6-BAR、弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant,FIA)、羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)、弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant,FCA)、牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等均购自Gibco公司；高碘酸钠(Na5IO6)、乙二醇(CH2OH)2购自阿拉丁公司；硼氢化钠(NaBH4)购自国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为市售分析纯，所用缓冲溶液均由本实验室自行配制。

1.1.2 实验动物 6周龄BALB/c小鼠购自郑州大学医学院实验动物中心，由实验动物中心饲养。

1.1.3 仪器 Nanodrop One微量核酸蛋白质含量测定仪购自美国Thermo Fisher公司；DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂；ME204E 型电子天平购自德国Mettler Toledo公司；ChemiDocTMXRS+型凝胶成像仪、550型酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原合成 采用高碘酸盐法[20]制备6-BA人工抗原，合成路线如图2所示。准确称取6-BAR标准品4 mg于离心管中，用2 mL甲醇溶解后再加2 mL 稀释液(pH值为7.4的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，PBS)稀释至1 g/L，边搅拌边向溶液中滴加2 mL浓度为0.01 mol/L高碘酸钠溶液，将反应液于室温下搅拌30 min，然后滴加360 μL浓度为0.1 mol/L的乙二醇溶液，室温下搅拌10 min。准确称取BSA 16 mg溶于4 mL PBS中，将上述反应液缓慢滴入BSA溶液中，用5%的K2CO3调pH值至9.3，室温搅拌1 h，每隔30 min滴加1次2 mL质量浓度为1 g/L的硼氢化钠溶液，共滴加2次，将反应液用0.1 mol/L HCl溶液调pH值至6.5，4 ℃搅拌1 h。最后将反应液移至透析袋中，在4 ℃环境下以PBS为透析液透析3 d，间隔8 h更换1次透析液，透析结束后即得6-BAR-BSA人工抗原，放入-20 ℃冰箱保存。同方法制备包被抗原6-BAR-OVA。

1.2.2 人工抗原鉴定

1.2.2.1 紫外扫描鉴定 用Nanodrop One微量核酸蛋白质含量测定仪检测6-BAR-BSA溶液的质量浓度，用PBS配制质量浓度为1 g/L的6-BAR-BSA、BSA、6-BA-OVA、OVA溶液，用甲醇与PBS体积比为1∶1的溶液配制6-BAR标准溶液，以PBS溶液作为空白基线，利用Nanodrop One微量核酸蛋白质浓度测定仪对其在220～320 nm波长进行扫描，根据最大吸收峰位置变化初步判定偶联效果。

1.2.2.2 SDS-PAGE鉴定 参照文献[21]的方法配制电泳缓冲溶液，浓缩胶体积分数为5%，分离胶体积分数为12%，电压选择80 V，上样量为10 μg，进行SDS-PAGE电泳。染色2～3 h，脱色12 h，每4 h更换一次脱色液，通过对比分子质量大小变化判断偶联效果。

1.2.3 6-BA多克隆抗体制备 选择4只6周龄雌性BALB/c小鼠，首次免疫用无菌PBS将免疫原6-BAR-BSA质量浓度稀释至500 mg/L，加入等体积FCA，经乳化后以每只50 μg的剂量采用背部皮下4点注射方法免疫。后3次免疫用FIA与免疫原等体积混合，其他操作步骤与首免完全相同。免疫间隔21 d。2免后每次免疫后间隔10 d断尾采血，5 000 r/min离心10 min后取上清冻存备用。

1.2.4 6-BA多克隆抗体鉴定

1.2.4.1 包板 用包被液(pH值为9.6的0.05 mol/L的CBS)将包被抗原6-BAR-OVA稀释至0.5 mg/L，取96孔聚苯乙烯板，每孔加入100 μL稀释后的包被抗原，放37 ℃恒温孵育2 h，用PBST(含有0.05% Tween-20的PBS溶液)洗板4次后拍干，每孔加满封闭液(5%脱脂奶粉溶液)，37 ℃孵育2 h或4 ℃孵育过夜，PBST洗板4次后拍干放4 ℃备用。

1.2.4.2 6-BA多克隆抗体效价测定 间接ELISA法[22]测定6-BA多克隆抗体效价。取已包被6-BAR-OVA的聚苯乙烯板，每孔加入100 μL PBS铺底，第1排加入1∶100倍稀释的小鼠血清后倍比稀释至倒数第2排，并设立空白，放37 ℃恒温孵育15 min；PBST洗板4次后拍干，每孔加入100 μL用封闭液稀释500倍的GaMIgG-HRP，37 ℃孵育30 min；PBST洗板4次，甩干后每孔加入100 μL显色液(TMB 磷酸-柠檬酸缓冲液)，显色10 min后，每孔加100 μL终止液(2 mol/L的硫酸溶液)并读取OD450值，当OD450值>0.2，且与空白孔OD450值之比>2.1时判定为阳性孔。阳性孔的最高血清稀释倍数即为血清效价[23]。

1.2.4.3 6-BA多克隆抗体敏感性鉴定 采用间接竞争ELISA法[24]测定6-BA多克隆抗体敏感性。取已包被6-BAR-OVA的聚苯乙烯板，每孔加入100 μL PBS，将质量浓度为5.12 mg/L的6-BAR标准品溶液或6-BA标准品溶液分别作为游离抗原，倍比稀释至倒数第3排，留阳性对照孔和空白孔不加游离抗原而加入100 μL PBS；然后除空白孔外，每孔加入100 μL效价测定时OD450值为1.0左右孔的前一孔所对应稀释度的多克隆抗体，其他操作步骤与效价测定相同。以抑制率B/B0为纵坐标(其中B为含有不同质量浓度游离抗原各孔的OD450值，B0为不加游离抗原孔的OD450值)，以游离抗原质量浓度的对数值为横坐标，绘制抑制曲线，推导线性回归方程，计算半数抑制浓度(IC50)，并以IC50值来评定多克隆抗体敏感性。

1.2.4.4 6-BA多克隆抗体特异性鉴定 选择激动素、赤霉素、4-氯苯氧乙酸钠、腐霉利、呋喃苯烯酸钠、BSA、OVA作为竞争物，利用间接竞争ELISA测定多克隆抗体对各竞争物的IC50。以6-BA的IC50与各竞争物的IC50的百分比作为交叉反应率。

1.3 数据处理

6-BA多克隆抗体血清抑制试验设3组平行，取3组数据的平均值用Excel 2016和Graph Pad 8作图并进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 6-BA人工抗原鉴定

2.1.1 6-BA人工抗原质量浓度测定 用Nanodrop One微量核酸蛋白质含量测定仪测得6-BAR-BSA质量浓度为3.0 g/L，6-BAR-OVA质量浓度为3.6 g/L。

2.1.2 紫外扫描 采用高碘酸盐法制备6-BA人工抗原后，首先利用UV法对人工抗原进行初步鉴定，6-BAR、6-BAR-BSA和BSA紫外扫描图谱如图3所示。从图3可以看出，BSA在278 nm处出现特征吸收峰，6-BAR在270 nm处出现特征吸收峰，而6-BAR-BSA的特征吸收峰介于二者之间，初步推测6-BAR和BSA偶联成功。图4为6-BAR、6-BAR-OVA和OVA紫外扫描结果，6-BAR-OVA与OVA和6-BAR的特征吸收峰也不重叠。由此推测，6-BAR和OVA偶联成功。

2.1.3 SDS-PAGE鉴定 半抗原与载体蛋白偶联后会使蛋白质分子质量变大，从而导致在SDS-PAGE电泳过程中泳动速度变慢。从图5可以看出，6-BAR-BSA和6-BAR-OVA的泳动速度均小于BSA和OVA，证明6-BAR和与BSA和OVA偶联成功。

2.2 6-BA多克隆抗体鉴定

2.2.1 6-BA多克隆抗体效价 在选择包被质量浓度时主要考虑2个因素，首先是提高灵敏度，其次是节约包被原。采用棋盘滴定法确定最适包被质量浓度，包被质量浓度依次为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 mg/L，采用间接ELISA法测其OD450值。由图6可见，包被质量浓度过高时，间接ELISA测定的OD450值并没有明显提高，不仅浪费包被原且还会降低间接竞争ELISA的检测灵敏度。因此，选择吸光值基本不变的最低包被质量浓度作为最佳包被质量浓度，不但可以大大提高灵敏度，更节约了检测成本。当包被质量浓度低于0.5 mg/L时，吸光值明显降低。因此，选择最低包被质量浓度0.5 mg/L来测定血清效价以及灵敏度。

由表1可以看出，用6-BAR-BSA免疫小鼠可以刺激机体产生抗体，4免后4只小鼠血清效价均在1∶51 200以上，其中2号小鼠血清效价最高达到1∶204 800。可见，制备的人工抗原能刺激小鼠机体产生抗体，6-BA人工抗原合成成功。

2.2.2 6-BA多克隆抗体敏感性 由表2可以看出，4免后6-BA对4只小鼠血清抑制效果明显，且对2号小鼠血清抑制效果最好，在最适包被质量浓度下，其抑制曲线如图7所示，线性回归方程为y=-0.175 1x+0.698 3，R2=0.995 3，且在(IC20～IC80)0.26～701.45 μg/L具有良好的线性关系，IC50为13.48 μg/L。由表3可以看出，6-BAR对4只小鼠血清也均有抑制效果。对2号小鼠血清的抑制曲线如图8所示，线性回归方程为y=-0.185 4x+0.732 6，R2=0.993 2，IC50为17.95 μg/L。以上结果表明，本研究制备的多克隆抗体可以与6-BA或其代谢物结合。

表3 6-BA多克隆抗体对6-BA间接竞争ELISA测定结果Tab.3 Indirect competitive ELISA results of 6-BA polyclonal antibody against 6-BA

2.2.3 6-BA多克隆抗体特异性 由表4可知，6-BA与6-BAR的交叉反应率为75.10%，与激动素、赤霉素、4-氯苯氧乙酸钠、腐霉利、呋喃苯烯酸钠、BSA、OVA交叉反应率均低于0.01%。交叉反应率越低，则说明特异性越强[25]。可见，本研究制备的6-BA多克隆抗体特异性强。

表4 6-BA多克隆抗体与竞争物的交叉反应Tab.4 The cross-reactivity of 6-BA polyclonal antibody with competimer

3 结论与讨论

6-BAR含有邻二醇结构，可以被高碘酸盐氧化成为醛基，然后与蛋白质分子中的氨基形成Schiff氏碱[26]，因此本研究采用高碘酸钠法把6-BAR与载体蛋白进行了偶联，相较于LI等[19]采用的碳二亚胺法，这个方法的优点是条件温和，不需要复杂的合成反应，可以在常温常压和中性pH值条件下进行。通过免疫小鼠得到高敏感性的多克隆抗体，证明以此方法合成人工抗原可以较好地保证抗原决定簇的完整性。由于6-BAR与6-BA具有相似的结构，其抗原决定簇可能相似。本研究结果表明，用6-BAR制备的多克隆抗体对6-BAR和6-BA都具有较好的敏感性，可以同时检测生产豆芽用水中的6-BA和豆芽中已经代谢的6-BAR。

本研究采用高碘酸盐法合成6-BAR人工抗原，通过免疫小鼠得到效价在1∶51 200以上的多克隆抗体，2号小鼠血清对6-BA和6-BAR均有较好的敏感性，在0.26～701.45 μg/L时线性关系良好，其检测6-BA的IC50为13.48 μg/L，对6-BAR的IC50为17.95 μg/L，与激动素、赤霉素、4-氯苯氧乙酸钠、腐霉利、呋喃苯烯酸钠、BSA、OVA的交叉反应率在0.01%以下。目前，已报道的高效液相色谱法[8-9]、电化学检测方法[14]等6-BA仪器检测方法的检测限在10 μg/L左右，与本研究结果差距不大。通过细胞融合制备的单克隆抗体灵敏度比相应的多克隆抗体的灵敏度提高10倍甚至更高[25]，因此，以6-BA单克隆抗体建立的免疫学检测方法相较于传统的仪器检测方法不仅会提高检测速度和降低检测成本，且在灵敏度上也将具有一定优势。

综上，本研究采用高碘酸盐法成功合成了6-BA人工抗原，通过免疫小鼠制备了敏感性好、特异性强的多克隆抗体。