干扰素对猪伪狂犬病毒增殖的影响

李聪聪，张世军，王红彩，张依盼，霍 永，姜东凤，宋素芳,2，牛 晖,3，姬向波，李婉涛

(1.河南牧业经济学院 动物科技学院，河南 郑州 450046； 2.河南省畜禽遗传资源保护工程技术研究中心， 河南 郑州 450046； 3.郑州市动物生殖分子调控重点实验室，河南 郑州 450046； 4.河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450046； 5.河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室，河南 郑州 450046)

中国作为猪肉消费大国，生猪规模化养殖在不断地扩大，对猪流行性疾病的预防和治疗也显得越来越重要。目前，猪场流行性疾病可以分为细菌性疾病和病毒性疾病两大类，而病毒性疾病是防治的重中之重。猪伪狂犬病(PR)是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种病毒性疾病，病死率高达80%～100%[1]，其中断奶仔猪死亡率10%～20%[2]，严重影响种猪场生产。PRV属于疱疹病毒科、猪疱疹病毒属，宿主几乎包含了所有的哺乳动物以及其他脊椎动物。PRV能在多种组织培养细胞内增殖，其中以兔肾和猪肾细胞最为敏感，可以引起明显的细胞病变[3]。PRV可以编码11种糖蛋白，分别是gN、gM、gL、gK、gI、gH、gE、gG、gD、gB和gC糖蛋白，其中gD糖蛋白不仅参与了病毒侵染宿主细胞的整个过程[4]，还是PRV主要的免疫原性糖蛋白之一，在PRV感染宿主的过程中有着重要的作用。 因此，gD基因的表达量变化能够反映PRV的增殖情况。

干扰素(Interferon,IFN)是一种糖蛋白，由英国科学家ISSAACS和LINDENMENN于1957年首先发现。根据基因的组成和蛋白质的功能，可以将IFN分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，Ⅰ型IFN通过诱导自噬参与细胞清除[5]，在急性感染中主要起保护作用[6]；Ⅱ型IFN主要在宿主早期抗感染过程中起重要作用[7]；Ⅲ型IFN主要是在上皮细胞表面表达，其在上皮细胞对抗病毒中起着重要作用[8]。Ⅰ型和Ⅱ型IFN通常起协同作用，激活多种适应性免疫活动，从而参与病原体感染的整个过程[9]。其中，Ⅰ型IFN包括IFNα、IFNβ、1FNδ、IFNε等亚型；Ⅱ型IFN主要是指IFNγ，是在人类第9号染色体新发现的一种细胞因子；Ⅲ型IFN主要是指IFNλ，发现较晚。研究表明，IFNα是由病毒感染白细胞后产生，IFNβ是由病毒感染成纤维细胞后产生，IFNγ是由抗原刺激细胞产生[10]。IFN能够在动物体内合成抗病毒蛋白来抑制病毒多肽链的形成，从而阻止病毒的增殖[11]。Ⅰ型IFN可以通过受体信号通路将信号传递到下游调节相关基因的表达，间接参与免疫功能的调节[12]。Ⅱ型IFNγ可以促使感染病毒的细胞和抗原递呈细胞产生MHC Ⅱ型分子[13]。目前，有关Ⅰ型和Ⅱ型IFN影响PRV在宿主细胞中增殖的研究报道相对较少[14]。

IFN并不能直接作用于病毒发挥其抗病毒功能，而是与细胞表面的IFN受体结合，通过信号转导器促进大量干扰素刺激基因(Interferon stimulated gene,ISG)的表达，ISG的大量表达可以使机体处于一种抗病毒状态[15]。ISG15(Interferon-stimulated gene 15,ISG15)是最早发现的ISG之一[16]，是在Ⅰ型干扰素的诱导下表达能力最强的刺激基因之一[17]。白细胞介素1β(IL1β)是在免疫反应中或者炎症状态下由单核巨噬细胞产生，在介导炎症反应、促进造血、调节免疫细胞等方面发挥重要作用[18]。白细胞介素6(IL6)是T淋巴细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞产生的淋巴因子，具有调节机体免疫功能、参与炎症反应及应激反应等多种生物学功能。白细胞介素10(IL10)是一种抗炎细胞因子，由单核细胞、淋巴细胞分泌，能够在转录水平抑制炎症因子IL1β、IL6、IL8、TNFα等的合成[19]，其在炎症和免疫调节中发挥多种作用。有研究表明，IL10和IFN存在相互竞争或相互作用诱导的细胞内机制，其相对强度决定了IFN诱导基因的转录[20]。因此，检测与IFN相关细胞因子的表达量变化情况，也可以间接反映IFN影响病毒增殖的情况。

IFN在抗病毒以及提升机体免疫力方面具有十分突出的作用，虽然其具有明显种属特异性[21]，但由于其在治疗猪的病毒性疾病中有较好效果[22]，在生产中应用广泛。目前，关于IFN影响PRV在宿主细胞中增殖的具体作用机制未见报道。鉴于此，研究Ⅰ型IFNα、IFNβ和Ⅱ型IFNγ对PRV增殖的影响，旨在探讨IFN的抗病毒机制，为IFN防治猪源病毒性疾病奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

猪肾细胞系(PK15)由河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室保存，PRV HNJY毒株由河南牧业经济学院李文刚教授课题组馈赠。试验所用引物信息见表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

1.2 IFNα、IFNβ、IFNγ表达载体的构建

以Ensembl数据库中记录的猪的IFNα(ENSSSCT00000087954.1)、IFNβ(ENSSSCT00045019653.1)、IFNγ(ENSSSCT00000055560.2)序列为模板设计引物，扩增猪IFNα、IFNβ、IFNγ基因完整的CDS序列。将扩增得到的IFNα、IFNβ、IFNγ基因的CDS序列连接至pcDNA3.1载体，载体构建成功后，提取无内毒素质粒备用。

1.3 PK15细胞培养、转染及攻毒试验

培养PK15细胞的完全培养基由10%FBS、89%普通高糖DMEM和1%青-链霉素组成，以上试剂均购自Hyclone公司。在转染前1 d，按每孔1.2×105个细胞的量接种至12孔板，将细胞置于 5% CO2、饱和湿度的37 ℃恒温培养箱中培养，待细胞汇合度达到60%～80%，采用Polyplus公司的Jetprime转染试剂进行转染，分为试验组和对照组，试验组分别为pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ3个表达载体，对照组(NC)为pcDNA3.1空载体，首次试验在转染24 h后收细胞，检测3个基因的表达情况。而后进行第2次转染试验，与前面不同的是，转染24 h后，在生物安全柜中以MOI为1接种PRV HNJY毒株，作用1 h后，PBS洗2次，换2%FBS+98%普通高糖DMEM的维持培养基，分别在接毒后的24、36、48 h收细胞。

1.4 病毒基因组DNA的提取及gD基因的检测

收集细胞后，采用上海生工生物工程有限公司提病毒基因组试剂盒(货号：B518261)，根据其说明书进行病毒基因组提取。将实验室保存的PRV-gD质粒进行10倍倍比稀释，在ABI7500系统进行实时荧光定量PCR(qPCR)，建立标准曲线；以病毒DNA为模板，对gD基因的表达量进行检测分析。15 μL的反应体系：7.5 μL 2×SYBR®Green Real-time PCR Master Mix (Toyobo公司)，50 pmol引物，75 ng模板DNA，补水至15 μL。扩增程序：预变性(95 ℃ 30 s)；变性(95 ℃ 5 s)，退火+延伸(60 ℃ 34 s)，进行45个循环；溶解曲线(95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s)。

1.5 细胞总RNA提取、反转录PCR以及qPCR

按照Trizol(Invitrogen公司)的说明书提取细胞的总RNA，用NanoDrop1000(Themo Fisher公司)测定RNA含量备用。对提取的细胞总RNA用DNaseⅠ(Themo Fisher公司)去除基因组DNA，接下来严格按照反转录试剂盒(KI622， Themo Fisher公司)的操作说明进行反转录，而后将得到的cDNA置于-20 ℃冰箱保存备用。用反转录所得到的cDNA作为模板，对细胞因子IFNα、IFNβ、IFNγ、ISG15、IL6、IL1β和IL10的表达量进行检测分析。采用15 μL的反应体系：7.5 μL 2×SYBR®Green Real-time PCR Master Mix，50 pmol引物，75 ng模板cDNA，补水至15 μL。扩增程序：预变性(95 ℃ 2 min)；变性(95 ℃ 15 s)，退火+延伸(60 ℃ 1 min)，进行45个循环；溶解曲线(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s)。以GAPDH基因作为内参基因，qPCR数据分析采用相对定量2-△△Ct法[23]。

1.6 数据处理

采用Graph Pad Prism 6软件对数据进行处理及作图，差异显著性分析采用t检验。

2 结果与分析

2.1 IFN在PK15细胞中的表达

将构建的3种重组质粒转染PK15细胞，24 h后收细胞，提取RNA反转录为cDNA，通过qPCR检测IFNα、IFNβ、IFNγ的表达量(图1)。从图1可以看出，与对照组相比，转染IFNα、IFNβ、IFNγ重组质粒的PK15细胞中IFN的相对表达量均上调600倍以上，说明3种基因在PK15细胞中超表达成功。

2.2 超表达IFN对PRV在PK15细胞中增殖的影响

2.2.1 感染PRV前后PK15细胞表型变化 待12孔板中的PK15细胞汇合度达到80%时，分别转染pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ重组表达载体，24 h后，将PRV HNJY毒株接种细胞，设定MOI值为1，分别在24、36、48 h观察细胞的生长状态，结果如图2所示。超表达IFNα的PK15细胞感染PRV后细胞形态与未攻毒时相比无明显差异，但正常形态细胞数量多于对照组；转染IFNβ的PK15细胞感染PRV后，细胞皱缩，48 h时明显脱落，死亡，但正常形态细胞数量仍多于对照组；转染IFNγ的PK15细胞感染PRV后，24 h时细胞出现明显的皱缩，36 h时细胞死亡严重，48 h时与对照组相比细胞形态差异不明显，正常形态细胞数量与对照组相当。

2.2.2 感染PRV后gD基因表达量的变化 在感染PRV后的24、36、48 h收细胞，提取病毒的基因组DNA，qPCR检测细胞中gD基因的表达量，如图3所示。与对照组相比，IFNα和IFNβ试验组gD基因的表达量在24、36、48 h显著上调；IFNγ试验组gD基因的表达量在24、36 h均极显著低于对照组(P<0.01)，在48 h与对照组无显著差异。

2.2.3 感染PRV后相关细胞因子表达量的变化 在感染PRV后的24、36、48 h收细胞，提取细胞总RNA，反转录为cDNA，检测不同时间点IFNα、IFNβ、IFNγ、ISG15、IL6、IL1β以及IL10的相对表达量，结果如图4、5所示。IFNα的表达量呈现下降趋势，但均极显著高于对照组(P<0.01)；IFNβ的相对表达量呈现先上升后下降的趋势，但均极显著高于对照组(P<0.01)；IFNγ的表达量呈现上升趋势，且极显著高于对照组(P<0.01)。

如图5所示，在IFNα试验组细胞中，ISG15的表达量随着PRV的持续感染呈现上调趋势，ISG15的表达量在24 h时与对照组相比无明显差异，36、48 h均上调表达，显著高于对照组(P<0.05)。在IFNβ试验组细胞中，ISG15的表达量呈现先上升后下降的趋势，在24 h时与对照组相比无明显差异；36 h上调表达，显著高于对照组(P<0.05)；48 h下调表达，极显著低于对照组(P<0.01)。在IFNγ试验组细胞中，ISG15的表达量随着PRV的持续感染呈现上调趋势，ISG15的表达量在24、36 h时与对照组相比均无明显差异；48 h时上调表达，但仍极显著低于对照组(P<0.01)。

在IFNα试验组细胞中，IL6的表达量呈现先上升后下降的趋势，IL6的表达量在24、36 h时与对照组相比均无明显差异，48 h时上调表达，显著高于对照组(P<0.05)。在IFNβ试验组细胞中，IL6的表达量呈现先上升后下降的趋势，在24 h显著低于对照组(P<0.05)，36、48 h均上调表达，极显著高于对照组(P<0.01)。在IFNγ试验组细胞中，IL6的表达量随着PRV的持续感染呈现上调趋势，与对照组相比，在3个时间点的表达量均上调表达，显著高于对照组(P<0.01)。

在IFNα试验组细胞中，IL1β的表达量呈现先上升后下降的趋势，IL1β的表达量在24 h时与对照组相比无明显差异；36 h时下调表达，极显著低于对照组(P<0.01)；在48 h时上调表达，极显著高于对照组(P<0.01)。在IFNβ试验组细胞中，IL1β的表达量呈现先上升后下降的趋势，在24 h极显著低于对照组(P<0.01)，36、48 h均上调表达，极显著高于对照组(P<0.01)。在IFNγ试验组细胞中，IL1β的表达量随着PRV的持续感染呈现上调趋势，在24 h极显著低于对照组(P<0.01)，在36、48 h时上调，极显著高于对照组(P<0.01)。

在IFNα试验组细胞中，IL10的表达量随着PRV的持续感染呈现下降趋势，IL10的表达量在24 h显著高于对照组(P<0.05)，36、48 h下调，极显著低于对照组(P<0.01)。在IFNβ试验组细胞中，IL10的表达量呈现先上升后下降的趋势，在24、36 h极显著高于对照组(P<0.01)，48 h表达量下降，但仍极显著高于对照组(P<0.01)。在IFNγ试验组细胞中，IL10的表达量随着PRV的持续感染呈现上调趋势，但在24 h极显著低于对照组(P<0.01)，36 h显著低于对照组(P<0.05)，48 h上调，极显著高于对照组(P<0.01)。

3 结论与讨论

3.1 转染IFN的PK15细胞感染PRV后对gD基因表达量的影响

IFN作用的发挥是一个复杂的过程，主要是通过一个IFN系统实现，表现为免疫调节、抗病毒和抗肿瘤的作用。本研究采用qPCR检测转染pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ重组质粒的PK15细胞攻毒后gD基因表达量变化，结果显示，IFNα、IFNβ试验组PK15细胞中gD基因的表达量在24、36、48 h均高于对照组。此前有试验证明，IFNα、IFNβ能够潜在抑制PRV的增殖[24]，然而这些试验并未探讨其抗病毒机制。本研究中，随着攻毒时间的增加，不同试验组gD表达量变化趋势不同，推测与IFNα、IFNβ、IFNγ瞬时转染PK15细胞有关。李厚伟等[25]在研究不同MOI的PRV对PK15细胞感染后细胞因子mRNA转录的影响时，分别用MOI为0.1、1.0、10.0的PRV感染PK15细胞，并且在1、2、3、6、12、24、48、60、72 h收集细胞，结果表明，在感染48 h且MOI为1.0时，病毒的DNA达到最高峰。本研究同样选用MOI为1的PRV感染PK15细胞，且在感染48 h时，gD的表达量达到高峰。因此，gD的表达水平也与MOI值有关。

3.2 转染IFN的PK15细胞感染PRV后对相关细胞因子表达量的影响

本研究中，感染PRV后，PK15细胞中的细胞因子IFNα、IFNβ、IFNγ、ISG15、IL6、IL1β和IL10的表达量发生显著变化。这些细胞因子表达水平的变化不但与PK15细胞瞬时转染IFNα、IFNβ、IFNγ有关，也与PRV的感染有关。ISG15所编码的蛋白质是在病毒感染期间起重要的抗病毒作用，其抗病毒作用在天然免疫中具有重要意义。在治疗PR时，猪源IFNα、IFNβ、IFNγ能否刺激ISG15的表达尚不明确。本研究结果显示，在IFNα试验组细胞中，ISG15的表达量显著高于对照组，说明IFNα可以刺激ISG15的表达。在IFNβ试验组细胞中，ISG15的表达量呈现先上升后下降的趋势，48 h下调表达，极显著低于对照组。推测在48 h时ISG15的表达量下调可能与PRV的增殖有关系。有研究发现，PRV可极显著抑制IFNβ调节的抗病毒反应[26]，且过表达ISG15可上调IFNβ的mRNA水平，并抑制PRV复制[27]。在IFNγ试验组细胞中，ISG15的表达量随着PRV的持续感染呈现上调趋势，与对照组相比，ISG15的表达量在48 h时上调，但仍极显著低于对照组(P<0.01)，推测IFNγ不能诱导ISG15的表达。IL6作为一种刺激因子，它可以直接或间接增强自然杀伤细胞(NK)的作用。在本试验中，IFNα、IFNβ、IFNγ试验组细胞在48 h时与对照组相比，IL6的表达量均上调。樊江平等[28]探讨IL1β、IL6、IFNγ在甲型H1N1流感病毒性肺炎患者血清中的表达，结果表明，与健康组相比，重症组和轻症组血清IL1β、IL6、IFNγ水平较高，且重症组高于轻症组。IL1β、IL6的上调可能引起了炎症因子风暴。本研究中，IL1β、IL6的表达水平可能与gD基因的表达水平有关。IL10是抗炎性细胞因子，能够抑制促炎细胞因子的产生，如TNFα和IFNγ。有研究发现,PRV感染PK15细胞能显著降低IL10启动子的甲基化水平，且PRV诱导IL10表达与病毒增殖密切相关[29-30]。由此，推测IFN通过调控IL10表达来影响gD基因的复制。综上，推测Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN通过不同途径影响PRV在PK15细胞中的增殖，Ⅰ型IFN，特别是IFNα是通过诱导ISG15的表达影响PRV增殖；IFNβ同样可诱导ISG15的表达，但还要借助于其他细胞因子比如IL6、IL1β、IL10来影响PRV增殖；Ⅱ型IFN影响PRV的增殖不依赖ISG15的表达，而是依赖于其他细胞因子比如IL6、IL1β、IL10的上调表达。各自具体的作用途径，还需要进一步的试验探讨。

本研究结果表明，在转染pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ重组质粒的PK15细胞中感染PRV之后，IFNα、IFNβ可诱导ISG15的表达，IFNγ对ISG15的表达并无明显促进作用，IFNα、IFNβ、IFNγ对IL6、IL1β的表达在一定条件下均有促进作用，IFNα抑制IL10的表达，IFNβ、IFNγ对IL10的表达具有一定促进作用，IFNα、IFNβ、IFNγ均影响gD基因的表达量。综上，IFNα、IFNβ、IFNγ经不同途径在不同时间段通过调控不同细胞因子的表达来影响PRV的增殖。