23株血液分离产KPC-2肺炎克雷伯菌毒力及同源性研究*

彭成 王璐 朱正荣 赵文紧 徐元宏

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，KPN）可引起肺炎、尿路感染、血流感染和肝脓肿等感染性疾病，是医院获得性感染的常见病原菌之一。近年来，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistantKlebsiella pneumonia，CRKP）的分离率不断上升[1]，患者感染后致死率较高，尤其血流感染CRKP，致死率高达70%[2]。近年有研究发现，决定肺炎克雷伯菌毒力的相关基因和碳青霉烯耐药基因可在菌株间传递，形成高毒力耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，给临床抗感染治疗带来极大挑战。本研究对血液分离23株CRKP菌株进行毒力基因、碳青霉烯耐药基因检测，应用多位点序列分型方法和脉冲场凝胶电泳技术进行分子分型，现报道如下。

材料与方法

1 菌株来源 收集六安市人民医院2018年1月～2019年12月分离自血培养的非重复CRKP菌株共23株（对厄他培南或亚胺培南耐药菌株）。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 1705（KPC阳性对照）系安徽医科大学第一附属医院检验科惠赠。

2 主要设备与试剂 主要仪器包括：VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏仪（法国梅里埃），热循环PCR仪T100、水平电泳仪及凝胶成像仪（美国Bio-Rad）。主要试剂：PCR试剂和Taq酶（日本Takara），亚胺培南纸片（10 μg）、厄他培南纸片（10 μg）（英国Oxoid），哥伦比亚血琼脂平板（上海科玛嘉），Muller-Hinton 琼脂平板（郑州安图），革兰阴性菌鉴定卡及药敏卡（法国梅里埃），所有引物均由上海生工公司合成。

3 菌株鉴定和药敏试验 使用细菌鉴定仪及配套的鉴定、药敏卡对血培养阳性转种在哥伦比亚血琼脂平板上的细菌进行鉴定及药敏试验，采用纸片扩散法复核厄他培南及亚胺培南的抑菌圈直径，根据美国临床实验室标准化研究所标准操作规程（CLSI-M100-29）进行试验操作及折点判断。

4 拉丝试验 用接种环将血琼脂平板上过夜生长的菌落轻轻混匀后向上拉起，拉出长度大于5 mm黏液丝即为拉丝试验阳性[3]。

5 碳青霉烯耐药基因、荚膜血清型基因及毒力基因PCR检测 采用煮沸法提取菌株DNA模板、采用PCR方法扩增常见的碳青霉烯酶基因：KPC、NDM、IMP、VIM、OXA-48及KPN的wzi基因、毒力基因：rmpA、aerobaction、kfu，引物合成及扩增条件参照文献[4-6]进行，见表1。阳性产物由上海生工公司进行DNA双向测序，测序结果用NCBI数据库进行BLAST比对。

表1 主要引物序列

6 多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 参照网站（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html）合成肺炎克雷伯菌7个管家基因（rpoB、phoE、gapA、infB、mdh、tonB和pgi）引物。采用PCR进行扩增，扩增产物由北京天一辉远公司进行双向测序，基因序列提交至网站获得相应的基因位点号及型号（sequence type，ST）。

7 脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE） 取哥伦比亚血琼脂平板上过夜培养的菌落，用0.85% NaCl制备吸光度值为4.0的菌悬液，取295 μL混悬液置37℃水浴孵育10 min后与混合液（1.2%金胶，1%十二烷基磺酸钠，0.2 mg/mL蛋白酶K）进行混匀，加入模具内，室温放置15 min后冲洗，4℃保存。手术刀片切2 mm宽的胶块置于100 μL稀释液内，37℃放置30 min后，将液体吸出，再加入限制性内切酶XbaI及酶切缓冲液120 μL，37℃水浴2 h。标准菌株H9812的处理方法同上。将脉冲参数设置为：电压6 V/cm，夹角120°，脉冲时间2.16～54.17 s，电泳时间19 h，泵设为70，温度14℃。胶块用EB液染色、纯水漂洗后，采用凝胶成像仪获得图像，使用BioNumerics version 7.6软件，选择Dice相关系数和非加权组平均法（Unweighted Pair-group Method With Arithmetic Means，UPGMA）进行脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）结果处理和聚类分析。

结 果

1 药敏结果 23株菌的亚胺培南和厄他培南纸片扩散法复核结果与仪器法结果一致，均为耐药。对氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢曲松、氨曲南、左氧氟沙星、环丙沙星全部耐药。头孢吡肟耐药率为87%，对阿米卡星和复方新诺明的耐药率分别78.3%和26.1%。

2 拉丝试验及分子特征 23株菌均携带KPC基因，经测序比对均为KPC-2型，拉丝试验及其余分子特征见表1。

表1 23株CRKP拉丝试验及分子特征

3 MLST结果及最小生成树 23株CRKP菌株中有18株为ST11型，4株为ST307型，1株为ST15型。将本次研究获得的3种ST型与ST 1-350型一同绘制最小生成树。使用BioNumerics 7.6.3中文版绘制，绘制方法使用BioNumerics内置MLST模板。结果显示本次研究中ST15型与ST11型亲缘关系较近，其中ST11型与主要流行的ST258型亲缘关系较近。结果见图1。

图1 肺炎克雷伯菌分离株最小生成树

4 脉冲场凝胶电泳结果 18株ST11型CRKP进一步分为3个PFGE型，见图2。A型为主要型别，共16株，包括A1型（6号菌，9～11号菌，14～15号菌，19～20号菌，22号菌），A2型（7～8号菌，17～18号菌），A3（21号菌），A4（12号菌），另有B、C型各有1株。

图2 脉冲场凝胶电泳结果及树状图

讨 论

本研究筛选分离自血液标本的23株非重复性CRKP，进行主要耐药基因携带情况、毒力及同源性研究。23株菌主要来源于ICU病房，其次为急诊内科和神经外科，与李军[7]等报道的血液来源CRKP主要来源为ICU、新生儿科和胰胆外科一致，说明ICU病房可能是血液CRKP分离的最主要科室，其余分布各医院之间略有差异。CRKP除对复方新诺明敏感性较高外，对其余被测抗菌药物耐药率均大于70%。23株菌均携带KPC-2基因，我们认为产KPC-2酶是我院KPN对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要原因。

近年来关于高毒力肺炎克雷伯菌（Hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HVKP）引起临床感染的报道不断增加，该菌与经典KPN不同，常侵犯免疫正常人群，且感染后进展迅速，病死率较高[8]。HVKP大多拉丝试验阳性，呈高黏液表型，与其多糖荚膜的过度表达有关。现已报道的荚膜多糖的血清型别至少有78种，其中以K1和K2型为主，但本次研究中的23株菌以K14.64型为主，与Carla Rodrigues的研究结果相似[9]，与国内部分报道不同[10]。由于本次研究仅选取了近两年分离自血液的碳青霉烯耐药菌株，可能不一定具有地区代表性，后续将对分离自临床不同标本及不同耐药表型的KPN进行wzi分型的研究，以获取更可靠的流行病学数据。

RmpA基因负责激活荚膜产生，使菌株表现出高黏液性和强毒力性。有研究发现，具有高黏液表型以及携带rmpA基因的KPN菌株对小鼠表现出更高的、与荚膜类型无关的致死性毒力。本次研究的23株CRKP中，18株菌拉丝试验阳性且同时携带rmpA基因，二者相关性较高，与LIN报道一致[11]，但同时有研究者发现，血液分离的CRKP未携带rmpA基因，仅7%携带rmpA2基因。之前有研究认为产KPC的KPN菌株不会同时携带rmpA等与毒力相关的基因[12]，但随着时间推移，以及研究的广泛开展，现已发现同时携带rmpA/rmpA2基因的CRKP[13]。Kfu基因是KPN铁运输系统的调节者，参与铁的获取，具有毒性和致病性[14]，本次试验检出一株携带kfu的ST15菌株，荚膜血清型为K19。

有研究发现，在我国产KPC-2肺炎克雷伯菌以ST11型为主[15]，本次研究23株CRKP中18株为ST11型，同样是主要型别。PFGE进一步将这18株菌分为3个分子型，其中A1型菌株中的6株（6号菌，10～11号菌，14号菌，19～20号菌）具有完全相同的PFGE条带，且均携带rmpA基因，提示这6株CRKP具有同源性，分析临床资料发现感染该6株菌的患者均来源于ICU，该型别菌株可能是导致ICU科室内感染流行的克隆菌株。本次研究中MLST最小生成树的绘制中存在的不足之处在于，受分析技术限制，未能将试验所得ST型与所有目前所有已知ST型一起进行分析，但考虑到ST258型为国外主要流行型别，ST11型为我国主要流行型别，因此将ST1-350型一起绘制最小生成树。

综上所述，本研究中血液分离耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药机制主要为携带KPC-2基因，优势ST型为ST11型。通过试验发现院内已出现携带毒力因子的CRKP菌株，应当引起临床和院感相关部门的重视，后续可扩大样本范围以及筛查其他KPN常见的毒力基因，进一步探查传播来源及途径。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突