杏林套种知母高产优质栽培模式筛选

王洪博， 蔡景竹， 麻文婕

(1.河北省胸科医院， 河北 石家庄 050041； 2.河北农业大学 农学院， 河北 保定 071000)

0 引言

【研究意义】知母属百合科多年生植物[1]，是常用的大宗中药材。知母的药用价值较高，具有清热泻火、滋阴润燥等功效，可用于治疗外感热病、肺热燥咳及内热消渴等症状[2-3]。【前人研究进展】近年来，知母的市场需求量不断增加，野生知母资源日趋匮乏，因此，人工栽培知母在市场中的占比逐渐升高[4]。知母与大田作物一样，合理的种植方式是其量产和优质的基础[5]。知母的外观性状，如分蘖、株高、直径粗细等植株外观形态影响知母的药用有效成分(如芒果苷含量和知母皂苷BⅡ)含量，从而影响其市场价格[6-8]。河北省张家口蔚县地形以丘陵、山地为主，全年干旱少雨，气候条件非常适宜知母的生长[9-10]。【研究切入点】近年来，由于人为滥采等原因，知母资源受到严重破坏。如何保护知母资源，合理开发和提高种植产质量已成为十分迫切的问题。【拟解决的关键问题】采用单因素试验和双因素试验研究不同繁殖方式、不同种植密度及不同基肥配比对知母生长指标和有效活性成分含量的影响，明确林下套种知母的生长特性及活性成分含量变化规律，寻找一种既省时省力又有效增收，同时又不破坏传统杏产业发展的新途径，为当地知母的高产优质规范化栽培，稳定脱贫及后续可持续发展提供技术支撑[11-12]。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在河北省张家口蔚县北水泉镇细弦子村进行。当地干旱少雨，无灌溉设备，土壤pH 7.64，沙质土壤，有机质含量为15.35 mg/kg。

1.2 材料

1.2.1 知母 知母种子及2年生植株，由蔚县惠农中药材合作社提供。

1.2.2 试剂 知母皂苷BⅡ标准品(批号20191221A)，纯度≥98.00%；芒果苷标准品(批号2019122101C)，纯度≥98.00%，均为江莱生物科技有限公司生产；超纯水、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)和冰醋酸(分析纯)，市购。

1.2.3 肥料 氮磷钾复合肥(下称复合肥)，N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15，购自欧化肥料科技有限公司；农家粪和猪粪，均来自河北博贞农家乐。

1.2.4 设备 SHIMADZU LC-15C高效液相色谱仪，沈阳益海大通仪器设备有限公司；ZORBAX Eclipse Plus色谱柱，济南赛畅科学仪器有限公司；OM-2000CT超声波提取机，上海欧蒙实业有限公司；DKZ-2电热恒温振荡水槽，上海双旭电子有限公司；FA1004电子天平，常州市幸运电子设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验预处理 1) 配制标准溶液。分别取知母皂苷BⅡ标准品和芒果苷标准品0.1 g，用50%甲醇水溶液稀释成浓度为1 g/L的标准溶液备用。2) 种子萌发。查阅资料[13-17]显示，正常情况下知母种子发芽率仅为40%～50%，在播种前几天，将种子放入60℃温水中浸泡10 h左右，然后晾干表皮水分，与2倍的湿润细沙搅拌均匀，其上盖细砂，再用地膜覆盖，周围用土压紧，当多数种子露白时，再取出播种。此方法可以提高种子的出苗率。3) 种苗培育。2年生知母种苗于2018年春天播种及分株，2019年6月作移栽秧苗备用。

1.3.2 标准曲线方程 将配制的知母皂苷BⅡ和芒果苷标准溶液用50%甲醇水溶液稀释制成浓度为10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L和100 mg/L的溶液，采用高效液相色谱(HPLC)法测定各浓度对应的峰面积。根据芒果苷和知母皂苷BⅡ的浓度(x)与峰面积(y)拟合标准曲线方程，采用外标法进行计算。

1.3.3 试验设计 2019年6月，选4块土质条件基本一致的杏林田地，面积均为3 m×24 m，其中，2块地用于不同基肥试验，另外2块地用做移栽密度试验，以筛选出最佳种植方式。

1) 不同播种方式对知母出苗率的影响。采用单因素试验设计，设2个处理，Z1，种子繁殖；Z2，分株繁殖。各播种300粒(株)，采用翻埋方式栽培，翻埋深度30 cm。

2) 不同基肥对知母生长和有效活性成分含量的影响。采用双因素试验设计，肥料种类(A)：A1，复合肥+农家肥；A2，复合肥+猪粪。施肥量(B)：B1，复合肥 3 700 kg/hm2；B2，复合肥3 700 kg/hm2+农家/猪粪200 kg/hm2；B3，复合肥7 450 kg/hm2+农家/猪粪470 kg/hm2。以单施农家肥200 kg/hm2为对照(CK)。

3) 不同移栽密度对知母生长和有效活性成分含量的影响。采用双因素试验设计，行距(A)：A1，行距30 cm；A2，宽窄行40 cm/20 cm。株距(B)：B1，株距10 cm；B2，株距20 cm；B3，株距30 cm。

1.3.4 样品采集及预处理 于2020年11月在每个区域采集具代表性的知母3株，去掉泥沙、须根及地上部分，只保留根茎，然后将其洗净、干燥并粉碎，各处理样品混匀备用。

1.3.5 指标测定 1) 知母生长指标测定。分别调查和测量各处理知母样品分蘖数、株高、根茎及地上部分干重和鲜重、须根干重和鲜重、根茎干重和鲜重等指标。2) 活性成分含量测定。取备用的知母根茎粉末0.1 g，用甲醇溶剂定容至100 mL，采用高效液相色谱(HPLC)法测定知母皂BⅡ含量和芒果苷含量。色谱条件：Shim-pack色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为已腈∶0.4%冰醋酸溶液为50∶50，检测波长为258 nm，柱温25℃，流速1.0 mL/min。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 19.0统计各个指标的平均数，并对数据进行方差分析或显著性检验。

2 结果与分析

2.1 标准曲线方程

芒果苷的标准品曲线方程为y=629.25x+5.841 2(R2=0.999 1)，知母皂苷B的标准品曲线方程为y=1.341 7x+5.416 0(R2=0.999 1)。表明，在工作浓度范围内，芒果苷和知母皂苷BⅡ标准品的浓度(x)与吸光度(y)存在良好的线性关系。

2.2 不同播种方式知母的出苗率

调查发现，有201粒知母种子出苗，占种子总播种量(300粒)的67%；分株繁殖有222株出苗，出苗率为74%。后续试验均以分株繁殖方式进行栽培。

2.3 不同基肥处理知母的生长性能与有效活性成分含量

2.3.1 知母的生长性能 从表1看出，基肥可以提升知母的生长性能，但不同基肥的影响程度有所不同。

1) 分蘖数。各施肥处理的分蘖数为2.37～5.08个，较CK(2.27个)提高4.41%～123.79%，依次为A2B3>A2B2>A1B2>A1B3>A1B1>A2B1>CK，其中，A2B3的分蘖数最多，显著高于其余处理；A2B2其次，为4.53个，较CK提高99.56%，与除A1B2外的其余处理差异显著；除A1B1和A2B1外其余处理较CK的增幅均超过60%；A1B1和A2B1显著低于其余处理。

2) 株高。各施肥处理的株高为66.91～82.80 cm，较CK(62.09 cm)提高7.76%～33.35%，依次为A2B3>A1B3>A1B2>A1B1>A2B2>A2B1>CK，其中，A2B3最高，显著高于除A1B3和A1B2外的其余处理；A1B3其次，为72.65 cm，较CK提高17.01%，与其余处理差异不显著；A1B1、A2B2和A2B1较CK的增幅较小，均不足10%。

3) 地上部鲜重。各施肥处理的鲜重为64.50～97.79 g，较CK(57.01 g)增加13.14%～71.53%，依次为A2B3>A2B2>A1B3>A1B1>A1B2>A2B1>CK，其中，A2B3最高，显著高于其余处理；A2B2其次，为81.33 g，较CK增加42.66%，显著高于A2B1和CK，与其余处理差异不显著；A1B2和A2B1较CK的增幅较小，均不足30%，且均与A1B1和CK差异不显著。

4) 根茎长度。各施肥处理的根茎长度为8.26～17.29 cm，较CK(7.11 cm)提高16.17%～143.18%，依次为A2B3>A2B2>A1B2>A2B1>A1B1>A1B3>CK。其中，A2B3最高，显著高于其余处理；A2B2其次，为13.17 cm，较CK提高85.23%，显著高于除A2B3外的其余处理；A1B3较CK的增幅较小，不足30%，与其余处理差异显著，与CK差异不显著。

5) 根茎最大直径。各施肥处理的根茎最大直径为1.02～2.33 cm，A1B1和A2B3较CK(1.38 cm)提高分别下降16.67%和26.09%，其余处理较CK提高5.07%～68.84%，依次为A1B3>A2B2>A2B1>A1B2>CK>A1B1>A2B3，其中，A1B3最大，显著高于其余处理；A2B2其次，为1.71 cm，较CK提高23.91%，显著高于A1B1和A2B3；其余处理间差异不显著；A1B1和A2B3较CK分别降低16.67%和26.09%，二者差异不显著。

6) 根茎鲜重。各施肥处理的鲜重为20.15～29.51 g，A1B1较CK(20.54 g)下降1.90%，其余处理较CK提高10.13%～43.67%，依次为A2B2>A1B3>A1B2>A2B3>A2B1>CK>A1B1，其中，A2B2最高，显著高于除A1B3外的其余处理；A1B3其次，为27.54 g，较CK提高34.08%，显著高于除A1B2外的其余处理；A1B1较CK降低1.90%，二者与A2B1差异不显著。

综上，A2B3知母的株高、鲜重和根茎长度3个生长性能指标均最高，A1B3略高于A1B2，但与A2B3差距都不大，CK各指标均最低。方差分析结果(表2)表明，基肥种类对株高、根茎鲜重和分蘖数的影响存在差异但不显著；施肥量对株高的影响不显著，对根茎鲜重和分蘖数的影响分别达极显著和显著水平；基肥种类与施肥量互作对根茎鲜重的影响达极显著水平，对分蘖数的影响达显著水平。

2.3.2 药用活性成分的含量 由图1看出，不同施肥处理知母芒果苷(占知母整棵重量的质量比)含量和知母皂苷BⅡ(占知母整棵重量的质量比)含量分别为1.01%～1.59%和10.23%～14.56%，均较对照(0.81%和7.43%)有不同程度的提高，分别依次为A2B2>A2B1>A1B3>A1B2>A1B1>A2B3>CK和A1B2>A1B1>A2B1>A2B2>A1B3>A2B3>CK。其中，芒果苷含量和知母皂苷BⅡ含量均以CK最低，A1B2的芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量总体都比较高，行距30 cm，株距20 cm是相对较好的种植密度。

图1 不同基肥处理知母的药用活性成分含量

2.4 不同移栽密度知母的生长性能及根茎的药用活性成分含量

2.4.1 知母的生长性能 从表3看出，不同移栽密度对知母生长性能的影响存在差异。

表3 不同移栽密度知母的生长性能

1) 分蘖数。各施肥处理的分蘖数为2.35～4.73个，A2B3和A2B1分别较CK(3.69个)下降4.88%和36.31%，其余处理较CK提高1.63%～28.18%，依次为A2B2>A1B2>A1B3>A1B1>CK>A2B3>A2B1。其中，A2B2的分蘖数最多，显著高于其余处理；A1B2其次，为4.22个，较CK提高14.36%，与除A1B3外的其余处理差异显著；A2B1显著低于其余处理；其余处理差异不显著。

2) 株高。各施肥处理的株高为65.84～87.45 cm，较CK(64.44 cm)提高2.17%～35.71%，依次为A2B2>A1B2>A2B3>A1B3>A2B1>A1B1>CK，其中，A2B2最高，显著高于其余处理；A1B2其次，为78.56 cm，较CK提高21.91%，显著高于除A2B3和A1B3外的其余处理；其余处理间差异不显著。

3) 地上部鲜重。各施肥处理的鲜重为74.58～93.33 g，较CK(74.58 g)增加0%～25.14%，依次为A2B2>A1B2>A1B3>A2B3>A2B1>A1B1=CK，其中，A2B2和A1B2较高，分别为93.33 g和91.16 g，A1B3和A2B3其次，分别为88.91 g和87.79 g，较CK分别增加19.21%和17.71%，四者均显著高于A2B1、A1B1和CK，但相互间差异不显著；A2B1较CK增加7.37%，但与A1B1和CK差异均不显著。

4) 根茎长度。各施肥处理的根茎长度为7.58～13.33 cm，较CK(7.32 cm)提高3.55%～82.10%，依次为A2B2>A1B3>A2B3>A1B2>A2B1>A1B1>CK。其中，A2B2最高，较CK提高82.10%，显著高于除A1B3和A2B3外的其余处理；A1B3和A2B3其次，分别为12.91 cm和12.79 cm，较CK分别提高76.37%和74.73%，三者差异不显著，但均显著高于其余处理；A1B1较CK的增幅最小，不足30%，与除CK外的其余处理差异显著。

5) 根茎最大直径。各施肥处理的根茎最大直径为1.22～2.18 cm，A2B3和A1B2分别较CK(1.45 cm)下降4.14%和15.86%，其余处理较CK提高1.38%～50.34%，依次为A1B3>A2B1>A1B1>A2B2>CK>A2B3>A1B2，其中，A1B3最大，较CK提高50.34%，显著高于其余处理；A2B1其次，为1.84 cm，较CK提高26.90%，显著高于其余处理；A1B2最低，与CK差异显著；其余处理与CK差异不显著，但均显著高于A1B2。

6) 根茎鲜重。各施肥处理的鲜重为20.54～30.33 g，A1B1较CK(21.52 g)降低4.55%，其余处理较CK提高4.60%～40.94%，依次为A2B3>A2B2>A1B3>A1B2>A2B1>CK>A1B1，其中，A2B3最高，较CK提高40.94%，显著高于其余处理；A2B2其次，为29.76 g，较CK提高29.99%，显著高于除A1B2外的其余处理；A1B1最低，较CK降低4.55%，二者与A1B3差异不显著，均显著低于其余处理。

经显著性分析(表4)，行距对根茎长度、最大直径和鲜重的影响不显著；株距对根茎长度的影响达显著水平，对最大直径和鲜重的影响不显著；行距与株距互作对知母的根茎长度和鲜重的影响达极显著水平，对根茎最大直径的影响达显著水平。

2.4.2 药用活性成分的含量 由图2看出，不同移栽密度知母芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量分别为0.59%～2.73%和4.62%～12.06%，均符合2015年版药典的要求，其中，各处理芒果苷的含量均较对照有不同程度的提高，为A1B1>A2B3>A2B2>A2B1>A1B2>A1B3>CK，A1B3芒果苷含量低于其他处理；知母皂苷BⅡ的含量除A1B1较对照提高外，其余处理均较对照有不同程度的降低，为A1B1>CK>A2B2>A2B1>A2B3>A1B3>A1B2，A1B2知母皂苷BⅡ含量低于其余处理。

图2 不同移栽密度知母的药用活性成分含量

3 讨论

研究知母繁殖方法、基肥施用和种植密度对制定知母规范化种植的标准操作规程，提高并稳定栽培知母药材产量和质量具有重要意义。种植密度影响每株知母所拥有的平均营养空间，进而影响知母的生长发育、产量、质量及经济效益。该研究筛选出旱地知母较适宜的种植方法，并揭示了其药用活性成分的特征，该方法种植的知母药用活性成分含量虽符合国家药典，但并不是最高的。该研究主要通过大量采样分析，先确定最佳的种植方式，进而考察施肥种类、施肥量和种植密度对药用活性成分的影响，由于知母生产区域性的差异，该研究缺少种植区域对知母药用活性成分影响的分析；此外，选择分析的药用活性成分相对单一，不利于对知母的质量分类。施肥种类、施肥量和种植密度对药用活性成分的影响理论上应该是联合影响，此方面缺少相关性分析，有待进一步深入研究。

从知母的出苗率和操作便捷性考虑，播种方式建议在收获时将刨出的根状茎的芽头切下来作繁殖材料，然后在早春发芽前或晚秋植株进入休眠期后分株繁殖。如果在晚秋栽植，最好在每株上面培土6～7 cm，第2年春天将土扒平，利于新芽出土生长。

4 结论

从知母单株生长性状、根茎外观性状以及根茎中药用活性成分考虑，杏林套种知母高产优质规范化栽培最佳模式：基肥最好用有机肥，种类与配比为农肥粪200 kg/hm2+复合肥3 700 kg/hm2，种植方式采用早春或晚秋分株繁殖，最佳移栽密度为株距30 cm，行距为宽窄行40 cm/20 cm，此时，知母分蘖数较少、株高较矮，根茎鲜重最大，根茎长度较大，分别为3.51个、72.80 cm、30.33 g和12.79 cm，且根茎有效活性成分芒果苷和知母皂苷BⅡ含量达最高，分别为2.67%和14.03%，符合国家药典标准。