柱状田头菇遗传转化体系启动子的筛选

崔祥华 陶南 程波普 赵永昌 陈卫民 李靖

（1.西南林业大学生命科学学院，昆明 650224；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，昆明 650223）

随着食用真菌遗传体系的深入研究与建立，越来越多的启动子被用于表达体系，寻找适合于不同菌类的启动子，对于构建高效的表达体系十分必要。目前，研究者对食药用菌中的多个启动子进行了克隆和序列分析，如香菇Lentinula edodes和草菇Volvariella volvacea中ras（ras gene）启动子、香菇和灵芝Ganoderma lucidum中gpd（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase）启动子、双孢菇Agaricusbisporus中spr1（serine proteinase gene）启动子、cel1（tryptophan synthetase gene）启动子和cel3启动子、香菇 gal1（glu-coamylase gene）启动子等［1-5］。目前，真菌着力于选择使用强启动子和同源启动子，以增强靶标基因的表达量，而同源启动子能识别调控因子，降低甲基化频率，提高其转化效率［6］。但也存在一些异源启动子活性较强的现象，如研究者利用蝉棒束孢菌Isaria cicadae内源gpd、tef（translation elongation factor）和组蛋白（histone）H3启动子分别与来自稻瘟病Magnaporthe grisea的H3和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）sod基因启动子进行比较，发现稻瘟病H3启动子起始转录活性更强［7］。因此，选择高效、适宜的启动子对于研究其功能基因过量表达有着重要意义。目前为止，研究者对香菇［8］、双孢菇［9］、金针菇 Flammulina velutipes［10］、平菇 Pleurotus ostreatus［11］、灵芝［12］等主要食药用菌都使用gpd启动子构建遗传转化体系，其它启动子用于表达体系的研究较少。

柱状田头菇（Cyclocybe aegerita），又称茶树菇［13］，是一种温带至亚热带地区春秋季生长的广温型木腐性食用菌，在国内外有着广泛的种植。目前为我国的第九大类食用菌种植菌类，当前可开发的十大珍稀食用菌之一［14］。随着柱状田头菇遗传发育及育种研究的深入，需要建立高效稳定的遗传转化体系，以满足其遗传及性状等方面解析的需要。前期研究中利用PEG介导的原生质体转化方法，结合荧光蛋白EGFP表达，建立了稳定的遗传转化体系，为进一步开展柱状田头菇的基因功能研究提供了研究手段［15］，但未对靶标基因的表达量做定量分析，缺乏对启动子引导基因表达做综合分析。

因而本研究利用基因组数据，分析gpd和actin基因序列特征，分别用不同长度基因片段作为启动子，与原始载体中的启动子做比对分析，进而对靶标基因的表达量进行分析，期望筛选到稳定高效的启动子和区域，为后期柱状田头菇基因功能分析提供有力支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：柱状田头菇菌株YSG，保存于云南省农业科学院菌种库。菌丝置于YPD固体培养基（0.2%蛋白胨，0.2%酵母粉，2%葡萄糖，1.5%琼脂粉，pH自然）中进行培养。质粒pAa含有潮霉素B磷酸转移酶基因hph与绿色荧光蛋白编码基因egfp。

高保真聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、重组克隆试剂盒ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司）；RNA提取试剂盒Plant RNA Extraction Kit、限制性核酸内切酶（宝生物工程大连有限公司）；胶回收试剂盒E.Z.N.A.®Gel Extraction Kit、质粒提取试剂盒Plasmid Mini KitⅠ、DNA提取试剂盒Fungal gDNA Isolation Kit（Omega公司）；反转录试剂盒FastKing RT Kit（with gDNase）（北京天根生化科技有限公司）；感受态细胞 TreliefTM5αChemically Competent Call（北京擎科生物科技有限公司）；溶壁酶（lywallzyme）（广东碧德生物科技公司）；裂解酶（lysing enzyme）、纤维素酶R-10、潮霉素B（Sigma公司）；Real-time PCR试剂盒iTaqTMUniversal SYBR Green supermix（美国Bio-Rad公司）。本研究所用引物合成及测序交由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司完成。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的构建及遗传转化 提取柱状田头菇菌株YSG的总DNA与RNA，通过反转录其RNA得到cDNA。根据CE Design V1.04设计引物，并在各连接片段的5′端与3′端加6-21 bp同源臂（表1），进行不同类型和长度启动子的靶标基因扩增。PCR 采用 50 μL 反应体系，包括 1 μL Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase，25 μL 2×Phanta®Max Buffer，1 μL dNTP Mix（10 mmol/L each），正向和反向引物（10 μmol/L）各 2 μL，100 ng模板 DNA，用无菌去离子水补齐。PCR扩增体系采用95℃预变性3 min；9 5℃变性 15 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 60 s，重复35个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳获得的片段胶回收备用。

用限制性核酸内切酶Pst I与EcoR V双酶切质粒pAa，酶切产物通过凝胶纯化回收，将其原有的egfp基因及其启动子替换成启动子actin-1、gpd-1、actin-2、gpd-2、Pumgpd和靶标基因mek（图1）。使用ClonExpress DNA多片段无缝克隆技术将启动子、功能基因片段顺序拼接克隆，分别得到重组载体pAa-actin-1、pAa-actin-2、pAa-gpd-1、pAa-gpd-2 和pAa-Pumgpd。

设计通用引物pAa-F/pAa-R扩增5个重组载体的转化用DNA长片段，PCR产物切胶回收后送交北京擎科生物科技有限公司昆明分公司测序。测序正确的五个重组载体的DNA长片段通过PEG介导的原生质体转化法转进菌株YSG的原生质体，通过潮霉素抗性筛选得到转化子。具体实验方法同陶南等［15］的实验方法。提取转化子DNA，设计验证引物PM-F/PM-R进行PCR扩增，切胶回收PCR产物送公司测序鉴定出阳性转化子。

图1 载体构建示意图Fig.1 Schematic diagram of plasmid construction

1.2.2 qRT-PCR检测 提取阳性转化子的RNA，反转录得到其对应的cDNA。选取柱状田头菇菌株YSG中的gpd基因作为内参，应用DNAMAN设计荧 光 定 量 PCR引 物：qMek-F、qMek-R、qgpd-F、qgpd-R（表1）。采用 20 μL 反应体系 ：10 μL iTaqTMUniversal SYBR®Green supermix（2×），1 μL正向引物，1 μL反向引物，8 μL ddH2O。反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环，每个样品设置3个重复。

2 结果

2.1 启动子与靶标基因mek片段的获得

扩增出的5个启动子片段长度分别为1 055 bp（actin-1）、600 bp（actin-2）、1 084 bp（gpd-1）、700 bp（gpd-2）、585 bp（Pumgpd）；靶标基因 mek加上两端同源臂序列后，片段长度约为1 180 bp（分别命名为Mek-A1、Mek-G1、Mek-A2、Mek-G2和Mek-PG）。通过凝胶电泳检测，各启动子与mek片段长度与预期相符（图2），产物片段测序结果与原序列一致。

2.2 启动子序列与元件分析

通过PlantCARE启动子在线分析软件，对基因actin、gpd、Pumgpd起始密码子上游启动子序列中作用元件进行分析。在启动子中，根据TATA-box与CAAT-box的作用。其中TATA-box又称核心启动子，为RNA聚合酶的结合处之一，与转录起始有关；CAAT-box作为真核生物分布较广的基因调节区，控制着转录起始的频率。在actin启动子中（图3-A），存在1个TATA-box元件，6个CAAT-box元件。在gpd启动子中（图3-B），存在3个TATA-box元件，6个CAAT-box元件。在Pumgpd启动子中（图3-C），存在2个CAAT-box元件。

2.3 转化用DNA长片段获取

通过多片段无缝克隆技术将启动子actin-1、gpd-1、actin-2、gpd-2、Pumgpd分别与功能基因mek顺序连接到载体pAa上得到5个重组载体pAaactin-1、pAa-actin-2、pAa-gpd-1、pAa-gpd-2和 pAa-Pungpd。用通用引物pAa-F/pAa-R分别扩增重组载体获得对应的用于原生质体转化的DNA长片段（图4），片段长度7 200 bp左右，包含了重组载体LB和RB之间的DNA片段。

图2 启动子与mek片段扩增Fig.2 Amplification fragments of promoters and mek

图3 启动子序列元件特征Fig.3 Characterization of promoter sequences and elements

2.4 柱状田头菇遗传转化及转化子筛选

通过PEG介导原生质体转化，转化子菌丝透过上层潮霉素筛选培养基形成白色菌落（图5-A），挑取白色菌落重新置于YPD（含150 μg/mL HYG）培养基中进行复筛，转化子在复筛时都能正常生长（图5-B）。

将挑取的转化子提取DNA，用引物PM-F/PM-R进行PCR扩增，结果（图6）显示转化子中均含有重组后的启动子和目的基因片段，说明挑取的转化子均为阳性转化子，可以用于后续的基因表达分析。

2.5 不同启动子驱动靶标基因表达水平

图4 重组质粒中转化片段扩增Fig.4 Amplification of transformation fragments in the recombinant plasmids

以YSG中gpd作为内参基因，通过qRT-PCR来检测功能基因mek的表达量。结果显示（图7），挑选出携带actin-1启动子的10个转化子中，过量表达的转化子有7个，过表达转化子得率达70%，表达量为对照3倍以上转化子有5个，最高表达量为对照的10.45倍；携带 actin-2启动子的3个转化子中，过量表达的转化子有3个，过表达转化子得率达100%，表达量为对照3倍以上转化子有1个，最高表达量为对照的6.23倍；携带gpd-1启动子的13个转化子中，过量表达的转化子有9个，过表达转化子得率达69.24%，表达量均低于对照的3倍，最高表达量为对照的2.93倍；携带gpd-2启动子的7个转化子中，过量表达的转化子有6个，过表达转化子得率达85.71%，表达量为对照3倍以上转化子有2个，最高表达量为原始启动子的7.75倍；携带Pumgpd启动子的4个转化子中，过量表达的转化子有3个，过表达转化子得率达75%，表达量为对照3倍以上转化子有1个，最高表达量为对照的4.31倍。综合分析显示，pAa-actin-1和pAa-actin-2两个启动子控制的过量表达及高表达转化子得率较其它3个启动子高，适用于构建柱状田头菇稳定高效转化体系。

图5 潮霉素抗性平板上转化子的筛选Fig.5 Screening of transformants on HYG plates

图6 部分转化子PCR验证Fig.6 PCR verification of partial transformants

3 讨论

随着越来越多食用菌基因组测序工作的完成，对于食用菌遗传转化体系建立的研究也更深入，为后续基因功能分析奠定重要的基础。启动子作为控制基因转录的重要元件，与功能基因的表达及其表达程度密切相关，是建立稳定高效遗传转化体系过程中关键组成部分。尽管研究者已从众多物种中分离获得了多种基因启动子用于载体构建，然而适合于不同物种的启动子不尽相同，需要进行全面筛选以找到合适的目标启动子。

在前期研究中，利用actin作为启动子，我们构建了柱状田头菇的遗传转化体系，菌丝中呈现明显的荧光信号［15］。本研究中进一步构建了不同基因和不同长度actin、gpd和Pumgpd启动子的表达载体，其中actin启动子选取全长actin-1与部分序列actin-2，所获得的过表达和高表达转化子比率比其它启动子更高，适合于后期的过表达载体构建。研究者多认为内源启动子更适合菌株本身驱动靶标基因的表达［16］，即与本研究中内源启动子gpd和actin优于外源Pumgpd结果相似，但也存在异源启动子优于本身内源启动子的现象［17-19］。由此可见，研究者在构建过表达载体时，进行启动子的对比筛选非常必要。

图7 5个启动子片段控制的mek基因表达水平Fig.7 Expression levels of mek gene controlled by five promoter fragments

此外，由于启动子片段大小可能会影响靶标基因的转录活性，推测转录元件的数量与种类造成启动子与转录复合体结合差异造成［20］，而本研究中不同长度的actin和gpd作为启动子，驱动的靶标基因表达量也有差异，其中携带长片段actin-1比段片段actin-2高表达（表达量为对照3倍以上）转化子得率高，而携带短片片段gpd-2比gpd-1高表达转化子得率高。因此选取的启动子片段大小对靶标基因表达确实有影响，但是造成驱动子片段驱动基因表达差异的原因还需要进行深入探讨。

4 结论

本研究通过对柱状田头菇内源gpd和actin基因启动子不同长度片段及外源启动子Pumgpd分别构建过表达载体，转化原生质体后挑选阳性转化子，对靶标基因的表达量进行分析，其中利用actin启动子构建的载体比其它基因启动子相对应载体所获得高表达的转化子得率更高，适用于后期的基因功能分析研究。