苗药黑骨藤治疗类风湿性关节炎分子机制研究——基于网络药理学

夏景富，龙明豪，吴晓勇

(1.贵州中医药大学第一附属医院 苗医药科，贵州 贵阳 550001； 2.贵州中医药大学第一附属医院 风湿血液科，贵州 贵阳 550001)

黑骨藤是贵州常用苗药，为萝藦科杠柳属植物西南杠柳(PeriplocaforresttiSchltr)的干燥根或全株，性温，味辛、苦，具有祛风除湿、活血消痈的功效，常用于治疗风湿痹痛、跌打损伤等症[1-2]。黑骨藤主要含有强心苷类、C21甾类，以及黄酮类、三萜类、香豆素类等成分[3]，现代药理研究表明黑风藤具有抗炎镇痛[4]、强心[5]、抗肿瘤[6]等活性。

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、炎症性的自身免疫性疾病，其典型特征为滑膜炎、滑膜细胞增生以及软骨组织损伤等[7]。中医认为RA属于“痹证”“顽痹”范畴，在治疗中主要使用祛风通络、清热除湿、活血化瘀、化痰散结等药物[8]。近年来，黑骨藤被广泛应用于RA的治疗。据报道，黑骨藤治疗RA的活性部位为黄酮类与苷类[9]，但活性成分尚不明确。此外，文献研究表明黑骨藤治疗RA的作用机制与调节免疫器官功能及下调促炎因子水平有关[10]，但具体的作用机制还有待进一步研究。本研究将采用网络药理学的方法预测黑骨藤治疗RA的有效成分及作用机制，以期为黑骨藤的深入研究及其临床应用提供参考。

1 方法

1.1 数据库及软件

中药系统药理学分析平台(TCMSP)、Swiss Target Prediction、Genecards、David数据库、人类基因和基因表型综合数据库(OMIM)、KEGG信号通路、PPI、Cytoscape 3.6.1软件、String数据库。

1.2 活性成分筛选

在CNKI、PubMed、《中华本草：苗药卷》、《中药大辞典》、《中草药汇编》、TCMSP中检索黑骨藤中含有的全部化学成分。将ADME参数OB≥30%及DL≥0.15作为筛选标准。

1.3 药物靶点的筛选

通过TCMSP数据库和Swiss Target Prediction数据库，筛选黑骨藤活性成分的作用靶点，共得603个靶点，建立成分靶点数据集。

1.4 疾病靶点筛选

在Genecards数据库、OMIM数据库中，检索与RA相关的基因及蛋白靶点4 157个，建立疾病靶点数据集。

1.5 收集疾病相关基因

在Genecards、OMIM数据库中，检索与APL相关的基因及蛋白靶点，建立疾病靶点数据集。将成分靶点数据集与疾病靶点数据集进行映射，绘制韦恩图，取两个数据集的交集，即为黑骨藤治疗RA的共同靶点。

1.6 网络构建与分析

在Cytoscape 3.6.1软件中导入黑骨藤活性成分及成分-疾病共同靶点数据，构建“药物-成分-疾病-靶点”网络，网络图中的节点代表药物、活性成分、疾病或靶点，边表示节点之间的相互关系。对网络图进行可视化分析，以Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality三个拓扑参数值为标准筛选黑骨藤治疗RA的关键靶点。在String数据库中导入关键靶点，构建PPI网络图。

1.7 关键靶点GO、KEGG通路富集分析

利用KEGG信号通路数据库中的KEGG Mapper功能分析与疾病密切相关的信号通路上的关键靶点，在David数据库作关键靶点的GO、KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 活性成分筛选

通过查阅文献，筛选黑骨藤的活性化学成分结果见表1。黑骨藤治疗RA的活性成分主要为甾类(如杠柳毒甙、胡萝卜甙、β-谷甾醇等)与萜类(熊果酸、齐墩果酸等)。此外，还有少量黄酮类(如山奈酚)与多酚类(咖啡酸乙酯)等。

表1 黑骨藤活性化学成分

2.2 成分靶点与疾病靶点收集

将药物靶点与疾病靶点映射取交集，绘制韦恩图，得到352个共同靶点，见图1。利用String数据库对韦恩图中的352个共同靶点进行蛋白互作关系分析，构建PPI网络图，见图2。

图1 黑骨藤-类风湿性关节炎靶点韦恩图

图2 关键靶点PPI网络图

2.3 网络构建与分析

将药物靶点与疾病靶点导入Cytoscape 3.6.1软件，构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图，见图3。图中菱形表示靶点，多边形表示疾病，三角形表示有效成分，椭圆形表示药物。对该网络图进行可视化分析，选择Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality三个拓扑参数均大于各自中位数值的靶点作为关键靶点，表2展示了Degree值靠前的10个核心靶点拓扑数值，Degree值越高，靶点与疾病的关联性越大。

图3 “药物-成分-疾病-靶点”网络图

表2 核心靶点相关拓扑参数

2.4 关键靶点GO和KEGG分析

在David数据库中对核心靶点进行GO生物学过程分析及KEGG通路富集分析，以P≤0.01(P值越小显著性越高)作为筛选标准，显著性最高的前10个生物学过程及通路结果见表3、表4。GO生物过程主要包括PI3K信号通路的调控、抑制细胞凋亡、促进NO合成、血小板激活等。KEGG通路富集结果显示，黑骨藤治疗RA的靶点主要富集在癌症相关通路、PI3K-AKT、ErbB、催乳素、雌激素、HIF-1等信号通路。

表3 GO生物学过程分析结果

表4 KEGG通路富集分析结果

2.5 构建通路图

利用KEGG数据库的KEGG Mapper功能，将核心靶点标注在与疾病密切相关的信号通路上，见图4。药物-疾病的共同靶点352个，如AKT1、IL-6、VEGF、MAPK3等，涉及细胞凋亡、一氧化氮(NO)合成、血小板激活、蛋白磷酸化、细胞增殖、T细胞聚集等多个GO生物过程，以及PI3K-AKT、ErbB、催乳素、雌激素、VEGF等多个信号通路。

图4 核心靶点在疾病相关信号通路上的标注图

3 讨论

本次研究应用网络药理学方法，预测黑骨藤治疗RA的活性部位集中在甾类、萜类、黄酮类，包含杠柳毒甙、萝藦甙元、熊果酸、胡萝卜甙等10种活性成分。药物-疾病的共同靶点352个，如AKT1、IL-6、VEGF、MAPK3等，核心靶点主要富集在PI3K/AKT、ErbB以及催乳素、雌激素信号通路。其中PI3K信号通路主要参与调控及抑制细胞凋亡、促进NO合成、血小板激活、促进蛋白磷酸化、促进细胞增殖、T细胞聚集等GO生物过程，其分子功能涉及蛋白激酶活性的激活、蛋白与酶的结合、ATP结合、蛋白激酶间的结合、转录因子结合、MAP激酶活性的激活等。

PI3K/AKT通路是参与细胞间信号传递的重要通路，对细胞增殖、凋亡等具有调控作用。而RA的病理变化包括滑膜炎症、软骨破坏与骨侵蚀、血管翳等，在这些病理过程中，PI3K/AKT可通过调节促炎因子水平而介导炎症反应，还可刺激TNF-α及IL-7等因子水平促进破骨细胞的生成、分化、迁移，最终破坏软骨与骨质，进一步加重RA。此外，PI3K/AKT通路还可通过调节HIF-1α及VEGF水平，促进RA血管生成，抑制滑膜对骨头的营养供给，同时释放多种炎症因子与蛋白水解酶对关节软骨等组织进行破坏，使得RA病情加重[11]。ErbB基因与多种自身免疫性疾病的易感性有关[12]，还参与肿瘤细胞的形成、迁移、入侵、扩散及增殖的各项过程[13]，但该靶点与RA的关联鲜有文献报道。催乳素与RA疾病严重程度具有一定相关性，其可激活MAPK信号通路从而促进IL-6的分泌[14]。RA的发生发展与雌激素水平也有一定关系，与正常人群相比，RA患者体内雌激素显著升高，雌激素还可延缓粒细胞凋亡进程，促进嗜酸性粒细胞浸润，并促进中性粒细胞分泌NO，增强抗炎作用[15]。雌激素可通过MAPK通路促进CD40的表达，从而参与到炎症反应的调控中[16]。此外，雌激素还可通过调节CD16的表达影响单核巨噬细胞释放细胞因子、调节IL-2影响T细胞的耐受与分化，促进Th2细胞的免疫应答，破坏Th1/Th2平衡，促进IL-4、IL-5、IL-12等因子的表达[17-19]。有研究表明，黑骨藤可能通过抑制MAPK通路、降低NF-κB活性、抑制炎症反应从而发挥抗RA活性[20]。

本研究采用网络药理学的研究方法分析了黑骨藤治疗RA的作用机制，预测了黑骨藤治疗RA的有效成分及其关键靶点、作用通路，体现了多成分、多靶点、多通路的作用特点，为黑骨藤治疗RA的作用机制研究提供了一定参考，今后可深入研究以上核心靶点及作用通路，进一步明确黑骨藤治疗RA的作用机制。