分析实时荧光PCR 技术检测结核杆菌的临床应用价值

刘梅，杨芳

济宁市公共卫生医疗中心检验科，山东济宁 272100

结核病是医学领域较难解决的一个问题， 且是一项全球性问题。 就目前的形式来看，该疾病的发生率逐年上升。 根据相关报道[1]全球范围内约有2 000 的结核病患者，除此之外，每年会大约出现900 万的患者，而这些患者中， 每年会有将近340 万患者因为结核病死亡，病死率较高，给全球人类均带来较大的影响。 结核病不论是在我国还是其他国家都是一个医学热点问题， 许多国家都将医学研究重点放在了结核病的预防和控制[2]。 要想有效预防结核病，就必须要及时并正确的诊断结核病， 目前临床对于结核病的确诊通常是涂片法与培养法，但这两种方法均存在着不同的弊端，必须另寻可靠的方法， 才能做好结核病的控制与预防[3]。该文随机选取2018 年 2 月—2019 年 2 月收治的 100例患者分析应用实时荧光PCR 技术对结核杆菌的诊断作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从该院收治的结核病患者中随机抽取100 例，其中男性 56 例， 女性 44 例； 年龄 20~61 岁， 平均年龄（43.26±4.05）岁；发病时间 2 个月~16 年，平均发病时间为（8.21±2.33）年。 所有患者均经由该院相关医学检查确诊为结核病患者， 患者的临床表现多为咳嗽、 咳痰等，部分患者会伴随气急、胸闷等临床症状。 研究得到医院伦理会批准和认可。 纳入标准：患者在知情的基础上自愿签署相关协议。 排除标准：单一或多器官功能衰竭；存在严重疾病者。

1.2 方法

标本采集：对所有患者进行标本采集，肺结核患者在早晨晨起体检时利用清水与30 mL 双氧水漱口，用力深咳，第一口痰吐于垃圾篓，收集患者第二口痰置于器皿中，送至检验科检测。 所有患者的痰标本均根据相关规程严格操作，应用涂片抗酸染色与结核菌培养进行实验室研究诊断。 抗酸染色法步骤：使用石碳酸复红滴入2~3 滴到涂片标本当中， 避免沸腾的情况下在火焰高处加热，出现蒸汽即离开，根据染液的减少情况适当增加，标本冷却后用水冲洗；利用3%盐酸酒精进行脱色，后用水冲洗；使用碱性美蓝溶液复染1 min，用水冲洗，并使用吸水纸将水分吸干，使用油镜观察。 将标本与化验单均根据相应的程序在样本接受处进行编号，并严格根据相应的程序操作。应用实时荧光PCR 技术（仪器编码MX3000P），根据《全国结核病诊断细菌学检验规程》当中的有关规定挑取痰液部分， 通过镜检后找到结核分枝杆菌判定为阳性，无结核分枝杆菌则为阴性。

痰液标本处理： 在痰液标本当中加入4 倍体积的4%氢氧化钠（NaOH），并将其摇晃均匀，在室温的环境下静置30 min 使其液化后，取出1 mL 的液体，将其离心。 离心速率设定在15 000 r/min，离心时间为5 min，离心后取出上清液，经过2 次的沉淀后加入1 mL 的无菌生理盐水，并盖紧混匀。 同时，采用实时荧光PCR 技术进行实验，该实验主要是提取DNA；该实验中应用全自动PCE 基因扩增仪， 根据标准作业程序相关规定进入扩增分析区，将扩增仪与电脑开启后进入系统，预热扩增仪的灯泡，然后按照标准程序进行下一步操作，电脑会自动生成相应的监测报告。 经25 μL 的反应体系反应结束后，检测标准品的循环阈值（Ct），检测方式为阳性梯度，如果Ct≤37 则为阳性，等于40 则为阴性，Ct在38~40 为可疑样本，针对可疑样本需要进行复检；经复检后Ct 无数值判定为阴性，否则为阳性。

1.3 观察指标

对所有患者应用实时荧光PCR 技术、 培养法与涂片法进行结核杆菌检测， 根据得出的数据分析所有患者的阳性率，并对其进行对比。 阳性率=阳性例数/总例数×100%。

1.4 统计方法

采用SPSS 22.0 统计学软件予以数据处理，计数资料以频数和百分比(%)表示，组间差异比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

应用实时荧光PCR 技术、培养法、涂片法检测患者的结核标本的阳性率分别为53%、32%、27%，实时荧光PCR 技术的阳性率明显高于培养法与涂片法， 差异有统计学意义（χ2=9.023、14.083，P＜0.05）。 见表 1。

表1 3 种方式检测阳性率对比

3 讨论

肺结核属于一种慢性传染病， 其特征为细胞免疫力低下，是由结核杆菌引起的，患病后对患者全身器官均有一定影响，从全球范围来看，约有1/3 的人感染结核杆菌[4-5]。 对于结核病的治疗原则是早期及时发现、及时诊断以及及时治疗， 通过这一方法可以有效控制肺结核感染情况，改善预后，对患者的生活质量也有一定的优化作用[6]。

目前临床针对肺结核疾病最准确的诊断方式就是结核菌分离培养方法， 但传统的培养法与涂片法检测效率并不高， 往往需要许多的工作人员共同进行实验室培养检测，消耗时间较长，在一定程度上影响了肺结核的检测速度，且检测的阳性率较低，不能准确地检测出患者体内的结核杆菌[7]。 为了克服传统涂片法与培养法的问题与弊端， 近年来随着医疗服务行业的不断进步，实时荧光PCR 技术应运而生，实时荧光PCR 技术一经出现就立刻试用于临床， 并在临床得到快速的发展，尤其是对肺结核患者的结核杆菌进行检测[8]。

实时荧光PCR 技术应用于检测结核杆菌中， 相比涂片法与培养法，具有更高的敏感度和特异性，即便是含有结核杆菌较少的标本， 如患者的尿液以及胸腹水等， 通过实时荧光PCR 技术也能有效检测出结核杆菌的存在，能够极大提升结核杆菌的检出率，提升检测效率[9]。 这一优势有助于医院及时对结核病患者进行有效干预，从而对患者进行有针对性的预防和控制。 在该次实验当中，同时对100 例结核病患者行涂片法、培养法与实时荧光PCR 技术检测法， 结果显示应用实时荧光PCR 技术检测法的检测阳性率均明显高于涂片法和培养法[10]。

实时荧光PCR 技术通过加入一条与靶基因序列互补的荧光双标记寡核苷酸探针，当患者的标本中出现特异性PCR 扩增的情况，则会出现特异性的荧光，根据荧光值的变化，能有效且准确的判定扩增产物的量[11-13]。但实时荧光PCR 技术的使用也受到一定的限制， 究其原因在于结核菌难能破壁以及样本当中存在着各种各样的抑制物，会导致其出现假阴性[14-16]。 如果在检测过程中出现假阳性的结果， 则首先要考虑标本是否受到污染， 也可以进一步分析是否扩增了患者体内潜伏的分枝杆菌。 如果患者体内有恶性肿瘤，则免疫抑制特性就会导致患者的结核病复发， 如果患者体内肿瘤坏死，则会将潜伏的结核分枝杆菌释放出来，将阴性转变为阳性[17-19]。

该次研究结果表明，应用实时荧光PCR 技术、培养法、涂片法检测患者的结核标本的阳性率分别为53%、32%、27%，实时荧光PCR 技术的阳性率明显高于培养法与涂片法。该文的研究结果与谭珂等[14]人的研究结论一致， 即应用实时荧光PCR 技术显示出的阳性数量明显高于涂片法与培养法的检测方式， 应用实时荧光PCR 技术检测患者的结核标本阳性率为56%， 培养法的阳性率为33%，涂片法的阳性率为26%，且差异有统计学意义（P＜0.001）。 说明，应用实时荧光 PCR 技术处理对结核杆菌DNA 具有更高的敏感性，检出率也更高。

综上所述， 实时荧光PCR 技术应用于结核杆菌的检测中具有较为明显的优势，且检出率也较高，有更高的应用价值。