玉木耳的鉴定及其生长最佳营养条件研究

李 鹏， 张 林， 熊 雪， 向 准， 杨彝华， 赵晓朋， 廖小锋， 万 诚

(1.贵州省生物研究所， 贵阳 550009； 2.贵阳学院， 贵阳 550005；3.贵州省山地资源研究所， 贵阳 550001)

玉木耳(Auriculariacorneavar. Li)属木耳目(Auriculariales)，木耳科(Auriculariaceae)，木耳属(Auricularia)，是同属中毛木耳(Auriculariapolytricha)的白色变种，是经吉林农业大学李玉院士团队杂交改良后的能稳定遗传的新品种，除了保持毛木耳抗杂能力强、生物效率高等优良特性外，还有高产的特点[1-7]，在同等生产条件下，其产量是黑木耳的近两倍，成本低，毛利高，经济效益可观。玉木耳颜色鲜亮，高蛋白、低脂肪，营养及药用价值丰富，有木耳中的“白富美”之美誉，同毛木耳一样是药食两用的大型真菌[8]。因此，玉木耳作为木耳中的“新贵”，是极具市场潜力的珍稀品种。有研究表明，玉木耳与毛木耳的主要营养性状有一定差异[9]，但同毛木耳一样具有降血糖、血脂，提高免疫力及抗氧化能力，改善脂代谢，减轻炎症，抗肿瘤以及保护酒精所致的肝功能损伤等功效[2-3,10]，长期食用有益于身体健康。目前我国吉林、辽宁、山东等省份已经成功推广[11]，近几年贵州省安龙县、播州区、玉屏县等地有零星种植。

贵州省委、省政府聚焦决战决胜脱贫攻坚和乡村振兴，纵深推进农村产业革命，大力推动食用菌产业裂变发展；科技兴农，良种先行，菌种的优劣直接影响着食用菌产业的成败。伴随贵州省食用菌产业的规模化发展，保障优质菌种的大量、快速供应显得尤为重要，进而对菌种的生产工艺、产量和质量等提出了更高的要求。为玉木耳能在贵州更好更快的推广，有必要在确保母种质量安全的前提下，筛选出玉木耳菌丝的最适营养条件，确保种源的快速高质量供应。本试验对玉木耳进行DNA对比鉴定以确定该种源的可靠，并进一步研究了不同营养条件对其菌丝生长的影响，力求筛选最适的碳源、氮源，为玉木耳优质母种的标准化生产提供理论依据，以期在今后生产实践中为玉木耳优质高产的标准化栽培奠定扎实的基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试玉木耳菌株由贵州省食用菌工程技术研究中心引进并提供，已于2019年在贵阳市白云区基地完成品种出菇验证。

1.2 实验培养基

活化培养基：马铃薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7 H2O 1.5 g，维生素B110 mg，琼脂粉20 g，去离子水1 000 mL，保持自然pH值。

基础培养基：葡萄糖 20 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，维生素B110 mg，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，保持自然pH值。

1.3 试验方法

1.3.1菌种活化

制备玉木耳活化培养基平板10个，无菌环境下将试管母种接种到玉木耳活化培养基上平板上(接种至平板的中心位置)，25 ℃恒温培养箱中培养活化8 d。

1.3.2ITS序列分析

采用购自生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取分离纯化真菌基因组DNA，提取之后的DNA选用真菌通用引物(ITS 1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS 4：TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR扩增。采用25μL的PCR反应体系：Template(基因组20～50 ng·μL-1)0.5μL；10×Buffer(和Mg2+)；dNTP(各2.5 mmol·L-1)1μL；Taq0.2μL；F(10μM)0.5μL；R(10μmol·L-1)0.5μL；加双蒸水至25μL。反应程序为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45个循环，55 ℃退火45个循环，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸8 min，4 ℃终止反应保存。扩增得到的PCR产物经1.0%琼脂糖电泳检测扩增结果后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序后登陆GenBank对比，通过BLAST对测序结果进行比对分析，下载最相近菌株的ITS rDNA序列，并构建系统发育树。

1.3.3不同碳源试验

以玉木耳基础培养基为对照，分别以等量果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉及糊精代替基础培养基中的葡萄糖，作为不同碳源培养基，每个处理5次重复，将玉木耳活化后的备用平板用5 mm的打孔器将菌落打成圆片，然后接种于不同碳源平板的中心位置，25 ℃条件下培养10 d，并采用划线法每日标记菌落直径(十字交叉法)，每24 h测量一次，测量菌落直径，同时记录菌丝萌发时间。菌丝铺满三分之二以上平板时，观察记录菌落的菌丝形态、色泽、菌落形状、菌丝长势和边缘特征等，用“+”、“-”表示菌丝的长势，“+”越多表示菌丝生长得越好、越健壮、均匀，“-”表示菌丝不生长。实验数据采用PASW Statistics 18.0统计软件进行分析。

1.3.4不同氮源试验

以等量的硝酸钾、尿素、玉米浆、豆粕粉、酵母浸粉、谷氨酸、蛋白胨、酵母膏、麦麸皮分别代替基础培养基中的氮源硫酸铵，每个处理5次重复，25 ℃条件下培养，后续操作同1.3.3。

1.3.5不同温度试验

将菌丝长至平板三分之二的活化平板用5 mm的打孔器将菌落打成圆片，然后接种于玉木耳活化培养基上，将接种好的平板分别放置在15 ℃、18 ℃、20 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、30 ℃、35 ℃的恒温培养箱中培养，每处理5次重复，后续操作同1.3.3。

1.3.6最佳碳氮源浓度组合

选定适宜碳源可溶性淀粉、蔗糖，氮源豆粕粉、蛋白胨，采用 L9(34) 正交表进行正交试验(即可溶性淀粉为10、20、30 g三个水平，蔗糖为5、10、15 g三个水平，豆粕粉为1.5、2.0、2.5 g三个水平，蛋白胨为1.5、2.0、2.5 g三个水平)，以不含碳源、氮源的基础培养基为基础，组合成供试培养基，见表1。其中选取的2个适宜碳源、氮源作为试验的四因素，每因素设计3个水平，得到9个试验组，每组5个平行，置25 ℃条件下培养，后续操作同1.3.3。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table 单位：g·L-1

经碳、氮源正交试验得到该水平最优组合培养基，若组合不在试验处理中，则进行验证培养。

2 结果与分析

2.1 DNA的提取及ITS序列分析

试验样品由生工生物工程(上海)股份有限公司做分子鉴定检测，经PCR扩增和序列测定，结果显示，玉木耳IS 00049-1、IS 00049-2号的rDNA ITS区段长度为595 bp、606 bp，所得序列进行Blast搜索，在Blast击中结果中下载e值达100%的序列，包含Auriculariapolytricha、Auriculariacornea两种，均为木耳科木耳属毛木耳[12-13]。再下载6种不同木耳属菌株(Auriculariafuslosuccinea、Auriculariareticulata、Auriculariadeicata、Auriculariaamericana、Auricularianigricans和Auriculariavillosula)rDNA序列共同构建系统发育树(图1)。系统发育树表明，本试验供试的菌株两次测序结果均同毛木耳相似性高达99%以上，所以，供试菌株为毛木耳下的一个分支。

2.2 不同温度条件对玉木耳菌丝生长的影响

结合表2、图2可知，在所选温度培养下，玉木耳菌丝生长差异明显，温度对玉木耳菌丝萌发、生长速度及生长曲线皆有显著影响，温度越低，菌丝萌发耗时越长，生长速度越慢，而随着温度的升高，菌丝萌发时间缩短，日均生长速度呈先升后降的趋势，其中温度在15 ℃时，菌丝日均生长速度最慢，仅达2.65 mm·d-1，且长势最差。温度在30 ℃时菌丝生长最快，日均生长速度达10.18 mm·d-1，在30 ℃和25 ℃条件下，玉木耳菌落形态及长势最佳。温度在30～35 ℃时，菌丝日均生长速度在p<0.05水平上明显快于其他温度，且菌丝长势也较好。终上所述，玉木耳菌丝在试验所选温度条件下均能正常萌发且生长，在25～35 ℃下生长较好，最佳温度为30℃，说明玉木耳属于中高温型食用菌。

表2 不同温度条件对玉木耳菌丝生长的影响Table 2 Effect of different temperature on the growth of Auricularia cornea var. Li mycelium

2.3 不同碳源培养基对玉木耳菌丝生长的影响

综合表3、图3可知，玉木耳对所选7种不同碳源均能有效吸收，萌发时间均为48 h，但菌丝日均生长速度差异显著，菌丝长势也不同，虽均为白色绒毛状圆形菌落，但在整齐度、健壮及浓密程度上差异明显(p<0.05)。以可溶性淀粉、蔗糖为碳源时，玉木耳菌丝生长速度明显快于其他几种碳源，其中可溶性淀粉培养下日均生长速度最高(8.04 mm·d-1)，同蔗糖培养下差异显著(p<0.05)，整体呈现出可溶性淀粉>蔗糖(7.39 mm·d-1)>糊精(6.12 mm·d-1)>麦芽糖(6.03 mm·d-1)>乳糖(4.19 mm·d-1)>葡萄糖(4.18 mm·d-1)>果糖(3.42 mm·d-1)的趋势，且在糊精和麦芽糖培养下，日均生长速度差异不大(p<0.05)。但从玉木耳菌落长势上看，可溶性淀粉、蔗糖和麦芽糖为碳源时长势最好，葡萄糖、果糖、糊精为碳源培养下长势一般，乳糖培养下菌落长势最差。且从玉木耳菌丝生长曲线来看(图3)，可溶性淀粉、蔗糖、糊精、麦芽糖4种碳源培养下玉木耳菌丝生长势快，葡萄糖、乳糖、果糖3种碳源培养下长势较缓。故综合各种指标，玉木耳菌丝生长的最佳碳源为可溶性淀粉，其次为蔗糖和麦芽糖。

表3 不同碳源培养基对玉木耳菌丝生长的影响Table 3 Effects of different carbon source media on the growth of Auricularia cornea var. Li mycelium

2.4 不同氮源培养基对玉木耳菌丝生长的影响

选择11种不同氮源进行试验，得到玉木耳菌丝生长情况(详见表4和图4)。结合玉木耳生长速度、长势及生长曲线可知，除氮源为尿素时萌发需用时72 h外，其他氮源培养下，玉木耳萌发均只需48 h。且氮源为豆粕粉时，菌丝日均生长速度显著高于其他氮源(8.42 mm·d-1)，其次为谷氨酸(7.89 mm·d-1)、蛋白胨(7.09 mm·d-1)和酵母膏(7.02 mm·d-1)，硫酸铵培养下玉木耳菌丝日均生长速度最低(5.13 mm·d-1)，且显著低于其他氮源培养(p<0.05)。而其中以豆粕粉、蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉为氮源时，玉木耳菌落形态、菌丝长势较好，尿素和硝酸钾为氮源时菌丝生长最差。且从菌丝生长曲线上看，在氮源为豆粕粉培养下，玉木耳菌丝生长势最高，氮源为尿素时最低。故综合玉木耳菌丝日均生长速度、菌落长势与形态、菌丝生长曲线可知，玉木耳最适氮源为豆粕粉，其次为蛋白胨、谷氨酸和酵母膏。

表4 不同氮源培养基对玉木耳菌丝生长的影响Table 4 Effects of different nitrogen source media on the growth ofAuricularia cornea var. Li mycelium

2.5 最佳碳氮源浓度组合

选取适宜碳源可溶性淀粉、蔗糖，适宜氮源豆粕粉、蛋白胨建立L9(34)正交表，进行4因素3水平正交试验，得到该玉木耳菌株萌发时间仍均需48 h，且菌落均为绒毛状整齐洁白圆形菌落，菌丝极为健壮且浓密度高(详见表5)。在正交试验所有培养基中，玉木耳菌丝生长速度与时间呈正相关，Y 1、Y 2、Y 3、Y 5处理下菌丝日均生长速度在(p<0.05)水平上显著高于其他处理，其中Y 3处理下最快(10.73 mm·d-1)，其次为Y 1(10.72 mm·d-1)、Y 2(10.50 mm·d-1)。综上可得在各实验处理中，玉木耳生长最佳的组合为Y 3(A1B3C3D3)。

表5 不同浓度碳氮源对玉木耳菌丝体生长的影响Table 5 Effects of different concentrations of carbon andnitrogen sources on the growth of Auricularia cornea var. Li Mycelium

由表6可知，4种因素R值大小为RA>RC>RD>RB，表明各因素对玉木耳菌丝生长速度的影响为A>C>D>B。由表7可知， 4种因素对菌丝生长速度的影响极显著(p<0.01)，表明4种因素对玉木耳菌丝生长速度均能起到关键作用。即玉木耳菌丝培养过程中，碳源中可溶性淀粉(A因素)为最重要的因素，其次氮源为豆粕粉(B因素)，接着是氮源蛋白胨(B因素)，碳源蔗糖(C因素)影响相对较小。按照各因素的最优水平，得到A1B2C3D1水平组合为本试验的最优水平组合，结合表1可知，该组合为可溶性淀粉10.0 g，蔗糖10 g，豆粕粉2.5 g，蛋白胨1.5 g。但该组合并不在试验处理中，将通过后续试验，验证A1B2C3D1为玉木耳菌丝培养最佳碳氮组合，该组合验证得到玉木耳日均生长速度为11.03 mm·d-1，比上述正交试验处理所得最佳组合Y 3(A1B3C3D3)平均每天高0.30 mm。

表6 碳氮源对玉木耳菌丝体生长的正交分析表Table 6 Orthogonal analysis table of carbon and nitrogen sources on the growth of Auricularia cornea var. Li mycelium

表7 玉木耳正交试验方差分析Table 7 Auricularia cornea var. Li orthogonal test variance analysis

3 讨论与结论

国内市场上的银白木耳、白木耳、雪耳、玉木耳、白毛木耳等均属于木耳属的白色变异菌株，为更好管理市场，李玉院士建议将毛木耳白色变异菌株统一称为“玉木耳”[7,11]。通过本研究可知，供试菌株与毛木耳相似性高达99%以上，可确定该菌株为毛木耳下的一个分支，说明此菌株来源可靠。进一步研究发现，玉木耳菌丝生长条件并不苛刻，属于中高温型食用菌，适温范围较广，在15～35 ℃均能生长，且在25～35 ℃下较为适宜，其中最适温度为30 ℃。王月等[5]，林汝楷等[6]，余姚[14]在对玉木耳的栽培要点梳理中得到玉木耳菌丝在8～36 ℃均能生长，且在22～32 ℃下较为适宜，与本研究结果相近。此外，玉木耳在营养生长过程中对所选7种碳源、11种氮源均能较好的吸收，其中适宜碳源有可溶性淀粉、蔗糖和麦芽糖，最佳为可溶性淀粉。总体而言，多糖及双糖更易被该菌株分解吸收，葡萄糖、乳糖及果糖等单糖碳源培养时反而生长较慢。适宜氮源有豆粕粉、蛋白胨、酵母膏，最佳为豆粕粉，该菌株对硫酸铵、硝酸钾、硝酸铵等铵态氮吸收较差。白背毛木耳也是毛木耳的一个品种，黄艺宁等[15]研究表明，白背毛木耳最佳氮源为蛋白胨、碳源为葡萄糖时长势较好，为蔗糖时生长较快，该品种在碳、氮源选择上同本研究有所不同，这说明虽同为木耳属毛木耳，但不同的品种在对碳氮源的选择上也是有差异的。张阔谭[16]对第三代杂交白色毛木耳变种的研究中得到其最佳碳氮源分别为葡萄糖和酵母膏。本研究中酵母膏同样为玉木耳的适宜碳源之一，但最佳碳源的差异很有可能是供试菌株品种不同所致，并且菌丝生长情况受培养基多种因子共同影响，两研究中最适碳源上的差异也有可能源于供试培养基其他成分。而培养基内不同成分影响因子的影响力大小也可通过正交试验所得[16-17]，但本试验尚未开展这类研究。本研究主要针对玉木耳适宜的碳源和氮源的选择进行了正交试验，分析得到玉木耳最优碳氮源组合为A1B2C3D1，即最佳碳氮混合培养基配方为可溶性淀粉10.0 g，蔗糖10 g，豆粕粉2.5 g，蛋白胨1.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，维生素B110 mg，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，为玉木耳优质母种生产提供理论依据，以期为玉木耳在贵州的引种示范和规模化、标准化推广奠定基础。