巢蕨组培快繁技术研究

段杰秋， 孙大宽， 向建英， 唐军荣

(1.西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室, 云南 昆明 650224;2.西南林业大学云南生物多样性研究院, 云南 昆明 650224)

巢蕨(Aspleniumnidus)又称鸟巢蕨，是铁角蕨科(Aspleniaceae)铁角蕨属(Asplenium)多年生常绿阴生草本观叶蕨类植物。巢蕨喜温暖阴湿环境，常附生于雨林中的树干或林下岩石上，原产于热带、亚热带地区，在我国海南、台湾、广西以及云南等地的原始丛林中也有分布[1]。巢蕨叶形优美，具独特观赏价值，是优良的园林景观和室内装饰植物[2-3]；整株入药，有强健筋骨、通活瘀血的功效，主要用于外伤、骨折、阳萎、头痛等症的治疗[4-5]；嫩叶富含矿质元素，在台湾花莲地区作为野生蔬菜食用，是一种新型食用的功能性野生蔬菜[6]。由于巢蕨孢子在自然条件下不易萌发，加之园林绿化应用上的普及和野生资源的采挖破坏，使得该物种野生资源数量急剧下降[7]。为保护巢蕨野生资源，同时满足市场需求，需加强巢蕨繁育研究。

巢蕨传统的繁殖方式主要有分株繁殖、孢子播种和组织培养，但传统的分株繁殖和孢子播种受制约因素多且繁殖率低[8]。采用植物组织培养技术对材料进行繁殖，具有繁殖速度快、不受季节限制等诸多优势。目前巢蕨的组织培养研究已有零星报道，使用的外植体包括孢子[9-10]、嫩叶[11]等。但是在植物组织培养过程中，即使同一物种，由于基因型的差异，对组培快繁的配方也会存在不同程度的差别[12-14]。基于此，本研究以巢蕨成熟孢子为外植体，对影响巢蕨离体繁殖的因素及成苗途径进行了研究，最终建立了试管内和试管外两种离体快繁成苗途径。研究结果为巢蕨组培快繁配方的选择提供了新的参考，也为快繁成苗途径的选择和使用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

巢蕨种植于西南林业大学温室大棚，待其孢子成熟时，收集孢子作为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1外植体的消毒

用电子天平称取上述成熟孢子0.05 g，将其置于容量为1.5 mL的离心管中。在无菌环境下，向离心管中注入浓度为0.1%的升汞溶液，并完全没过孢子，消毒8 min后进行离心。用滴管吸出上层液和孢子囊壳，再用无菌水清洗3～5次后，将其稀释成0.05 g·mL-1孢子悬浊液，备用。

1.2.2孢子萌发动态观测

将孢子悬浊液分别接种到MS、1/2 MS和1/4 MS培养基上，附加30 g·L-1蔗糖，4 g·L-1琼脂，pH=5.8。试验共设3个处理，每个培养基接种1 mL悬浊液。定期观察拍照，培养第18天时统计孢子萌发率(将培养基置于显微镜同一倍镜下进行观察，随机各选取10个视野，统计每个视野的孢子萌发率，其均值即为该处理孢子萌发率)。

1.2.3配子体增殖配方筛选

以1/2 MS为基本培养基，附加30 g·L-1蔗糖，4 g·L-1琼脂，pH=5.8。采用正交试验法将6-BA与NAA以不同浓度配比(表1)添加到培养基中。试验选取孢子萌发后形成的配子体团(直径约0.8 cm)，平铺接于培养基中。试验共设9个处理，3次重复。培养过程定期观察配子体生长情况，60 d后统计增殖情况。

表1 试验设计Table 1 Experiment design

1.2.4试管内成苗途径

1) 配子体诱导成苗。以1/2 MS为基本培养基，附加30 g·L-1蔗糖，4 g·L-1琼脂，pH=5.8。将增殖得到的配子体团平铺转接于培养基中。在培养过程中延长配子体培养时间(对照)、添加适量无菌水和液体1/2 MS ，并定期适当摇晃。试验共设3个处理，3次重复，培养过程定期观察诱导情况。

2) 诱导GGB快繁成苗。将1) 中获得的部分小苗，分别转接至MS+6-BA 1 mg·L-1、MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1及1/2 MS+IBA 0.6 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1三种诱导培养基上，附加30g·L-1蔗糖，4 g·L-1琼脂，pH=5.8。试验共设3个处理，各含30株小苗，3次重复，培养 60 d后统计GGB诱导情况。

3) 小苗生根。以获得的小苗为材料，分别转接至含有IBA(0、0.5、1.0、1.5 mg·L-1)的 1/2 MS培养基中，附加30 g·L-1蔗糖，4 g·L-1琼脂，pH=5.8。试验共设4个处理，各含10株小苗，3次重复，培养60 d后统计小苗生根情况。

1.2.5试管外成苗途径

试验选取“泥炭藓”和“泥炭藓∶蛭石=2∶1”两种栽培基质，将增殖得到的配子体瓶苗移至室内自然光下适应7 d后，将其切成直径约为0.8 cm的小块，均匀移栽入上述基质中，浇水覆盖保湿。培养过程中，分别为两种基质喷施冷开水和1 g·L-1的 KH2PO4。试验共设4个处理，各处理约含200个配子体，3次重复，培养60 d后统计成苗情况。

1.2.6培养条件

试验均在室温(25±2)℃，光照2 000 lx，光周期为12 h·d-1的条件下进行培养。

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS 17.0、Excel 2007等软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 孢子萌发情况

接种在 MS、1/2 MS和1/4 MS培养基上的孢子萌发时间和萌发率不同。由表2可知，巢蕨孢子在3种培养基上都可以萌发，但不同处理间萌发率差异显著，孢子在1/4 MS 培养基上萌发效果最好，萌发率高达91.75%。3种不同浓度MS培养基中，随着无机盐浓度降低，萌发率升高，可见低无机盐浓度有助于巢蕨孢子萌发。孢子萌发动态见图1，其中，巢蕨孢子接种约1周后开始萌发，即分裂出初生假根和原始细胞(图1-a)；接种约2周时处于丝状体时期(图1-b)；3周则处于片状体时期(图1-c)；接种1个月后逐渐长成配子体(图1-d)。

表2 不同基本培养基对孢子萌发的影响Table 2 Effects of different basic media on spore germination

2.2 配子体增殖配方筛选

不同配方处理的配子体增殖系数和生长状况存在差别。由表3可知，9个处理的增殖系数均达到4倍及以上，可见巢蕨配子体增殖过程对培养基激素配方适应性较广。但B1、B2、B3和B7处理的增殖系数较高，且生长状况较好，其中 B7处理的增殖系数最高，且配子体生长状态最好。综上，B7处理(6-BA 0.3 mg·L-1，NAA 0.2 mg·L-1)是巢蕨配子体增殖的最适激素组合(图2-a)。

2.3 试管内成苗途径

2.3.1配子体诱导成苗

在增殖培养获得大量的配子体后，进行配子体诱导成苗。由于在前期采用表3的配方进行长时间培养后，配子体未能正常成苗，因此，增加了使用不同诱导剂对配子体进行处理的成苗试验，结果见表4。可以看出，对照处理在经过较长时间培养后也能长出小苗，但C1、C2处理的配子体成苗时间和成苗率都明显优于对照组，C1、C2处理的成苗效果无显著差异(图2-b)。由此可见，配子体在试管内经长时间培养后也能成苗，但添加液体诱导剂有助于配子体成苗。

表3 不同激素组合对配子体增殖的影响Table 3 Effects of different hormone combinations on gametophyte proliferation

表4 不同处理的配子体成苗情况

2.3.2GGB诱导及快速增殖

为了使获得的小苗快速增殖，以上节中获得的小苗为材料进行GGB的诱导。由表5可知，3种培养基配方D1、D3与D2的诱导结果间存在显著差异。D2处理的GGB诱导率达94.33%，GGB增殖效果明显优于D1和D3处理，且GGB长势较好、易分化出丛生苗(图3-bc)。综上，D2处理(MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1)最适合诱导GGB。

表5 不同处理的GGB诱导及增殖情况

2.3.3小苗生根

将获得的小苗转接到不同的生根培养基中，生根效果和生长状态存在差异。由表6可知，对照组处理的小苗，生根率最低、生根数量较少且后期小苗生长状态不佳；E1、E3与E2处理的生根结果间无显著差异。其中E2处理(IBA 1 mg·L-1)的生根情况最好(图4)，小苗均能生根，根多且粗长，小苗整体生长健壮，生根后按常规移栽炼苗管理容易成活。

表6 不同处理的小苗生根情况Table 6 Rooting condition of seedlings with different treatments

2.4 试管外诱导成苗

由表7可知，不同处理的配子体试管外诱导成苗结果差异显著。其中，F2与F4处理的小苗诱导率显著高于其他处理，且小苗颜色鲜绿、长势较好(图5-bd)。由此可见，喷洒1 g·L-1的 KH2PO4溶液，能明显促进配子体试管外成苗。待小苗生长稳定后，将其进行定植，定植后60 d时，小苗颜色鲜绿，长势较好(图6-a)；定植后第100天时，长势最好的小苗株高11.8 cm，叶宽1.4 cm，且颜色呈现深绿色，生长健壮(图6-b)。综上，两种栽培基质对配子体成苗影响无差异，但KH2PO4溶液能有效促进配子体试管外成苗。

表7 不同处理的配子体成苗情况Table 7 Comparison of seedling formation by gametophyte in different treatments

3 结论与讨论

巢蕨繁殖主要靠孢子，但普通条件下难以萌发，即使是人工进行播种，其繁殖周期也较长，孢子萌发率低，不易出苗，因而难以被生产采用[15]。但通过组织培养的方式则能够实现在较短时间内获取大量种苗的目标，进行规模化生产。在蕨类植物组织培养过程中，除了某些孢子具有休眠特性的物种外，通常情况下孢子在接种后2～5周萌发。有研究指出，巣蕨孢子在接种1个月左右萌发，即肉眼可见绿色小点[9,16]。而本试验利用显微镜进行观察，发现巣蕨孢子接种约1周后开始萌发(分裂出初生假根和原始细胞)，2～3周内则逐渐从丝状体向片状体转变，接种1个月后逐渐生长为成熟配子体。一般情况下，蕨类孢子类似于种子植物的种子，体内存储的营养物质能提供早期萌发需要[17]。本研究发现，巢蕨孢子随着无机盐浓度降低，萌发率会呈递增趋势，高浓度无机盐会抑制巢蕨孢子的萌发。这可能是因加入无机盐后，培养基的渗透势较高，延迟了孢子外壁破裂的时间，从而抑制假根和原叶体细胞的发育[18]。但也有研究认为，全量MS培养基最适于孢子萌发[19-20]。例如，在水蕨孢子萌发中，随着培养基成分的降低，水蕨孢子萌发率呈递减的趋势[21]。可见不同物种的蕨类植物在无菌培养中，对培养基无机盐浓度的要求不同。本研究得出低无机盐浓度的培养基有助于巢蕨孢子萌发。

在植物组织培养中，植物生长调节剂是培养基中的关键物质，在植物组织培养中起着重要的作用。在巢蕨的离体培养过程中，植物生长调节剂也发挥重要的作用，适宜浓度的激素如 NAA、6-BA 和2,4-D 等对巢蕨配子体的增殖分化有良好的促进作用。本试验中，6-BA浓度为0.3 mg·L-1、NAA 浓度为 0.2 mg·L-1处理的配子体，增殖系数最高，且配子体在9个不同激素浓度配比的培养基中，增殖倍数都达到4倍及以上。由此可见，巢蕨配子体增殖过程对培养基激素配方适应性较广。此外，对于配子体成苗，有研究发现，巢蕨无菌播种产生的配子体，在固体培养基上未能直接诱导出小苗，提出巢蕨诱导成苗有赖于水作为媒介[16，22]。本试验也证实了这一结果，通过增加继代次数并延长培养时间，同时添加诱导剂作为媒介，可以促进巢蕨的配子成苗。但也有研究者将巢蕨配子体团转入固体培养基中，培养25 d后分化出小苗[23]，与本试验前期难以诱导成苗的结果不同。因而可猜想在植物组织培养过程中，即使同一物种，也有可能会因为基因型、外植体类型、年龄以及培养基中的激素存在差异，而导致植株再生能力和组培快繁的效果存在不同程度的差别[12-14]。由此，可进一步探讨基因型对组培植株再生能力的影响，需要进一步的分子证据来揭示其作用机制。

在巢蕨试管内成苗中，配子体难以转化为小苗，通过添加诱导剂的方式能诱导出小苗，但成苗率极低。此时，再以诱导出的小苗为材料，进行GGB的诱导，可实现巢蕨小苗的快速增殖。这表明GGB方式是实现巢蕨试管内小苗快速增殖的理想途径。但是GGB诱导后的小苗，还需要经过生根和移栽炼苗，这相对于配子体试管外成苗而言所需要的成本更高。试管外成苗所需时间短且成本低，但在管护时要特别注意控温控湿，否则极易造成配子体死亡。因此，在巢蕨快繁时，选用何种途径进行工厂化育苗，可根据自身特点进行综合考虑。本研究建立的2种巢蕨快速育苗途径，为巢蕨的种苗工厂化生产提供了技术支撑，有助于巢蕨的种质资源保护和产业化发展。