补肾益气和血方对卵巢储备功能下降大鼠血清性激素和卵巢组织VEGF及其受体蛋白表达的影响

尹 燕，金志春，2，杨雅琴，唐 娜，李 卉

(1. 湖北省妇幼保健院，湖北 武汉 430070；2. 湖北中医药大学，湖北 武汉 430065)

卵巢储备功能下降是指卵巢内存留的可募集卵泡数量减少，卵巢产生卵子能力减弱，进而出现生殖内分泌功能紊乱和生育能力下降。卵巢储备功能下降的发病原因尚不明确，可能与遗传、免疫、医源性、心理、环境和感染等因素有关。卵巢储备功能下降进一步发展有可能导致卵巢早衰，直接影响女性的生育、工作及家庭生活质量。中医认为卵巢储备功能下降的发生多与肾相关,前期研究表明补肾活血中药具有整体调控的优势，能改善卵巢早衰患者生殖内分泌、免疫等系统功能[1-3]。本研究在用雷公藤多苷片制备卵巢储备功能下降大鼠动物模型的同时给予补肾益气和血方，通过观察大鼠血清性激素水平和卵巢组织中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体蛋白的表达变化，探讨其作用机制，现将结果报道如下。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级性成熟雌性SD大鼠，12周龄,体重250～280 g，由武汉华联科生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018，合格证编号：42000600029456。

1.2实验仪器及试剂 MD1000型正置显微镜(徕卡显微系统有限公司)；移液器(吉尔森P型移液器公司)；DHG-9023A型恒温烘箱(上海恒一科学仪器有限公司)；RM2235型石蜡切片机(徕卡显微系统有限公司)；TB-718L型生物组织包埋机-冷冻机(泰维科技)；TKD-TSF自动组织脱水机(湖北康强医疗器械有限公司)；酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan MS公司)。促卵泡生成素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、抗苗勒管激素(AMH)和血管内皮生长因子(VEGF)及其受体flt-1、kdr酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自武汉贝茵莱生物技术有限公司。兔抗鼠VEGF 多克隆抗体购自艾博抗(贸易)有限公司，批号：Ab32152；即用快捷型免疫组化MaxVision TM试剂盒、DAB 浓缩型试剂盒均购自武汉贝茵莱生物技术有限公司。

1.3实验药品 雷公藤多苷片:湖南协力药业有限公司生产，批号：20150607，规格：10 mg /片，50片/盒；补佳乐(戊酸雌二醇片)：拜耳医药有限公司生产，批号：510A，规格：1 mg/片，21片/盒。补肾益气和血方为全国第六批老中医药专家金志春教授经验方，组成:熟地15 g、菟丝子15 g、补骨脂10 g、龟板胶15 g、鹿角胶15 g、山茱萸15 g、山药15 g、枸杞10 g、当归10 g、白芍10 g、川芎12 g、益母草10 g、党参15 g、黄芪15 g。上述各味药均为免煎颗粒剂，由华润三九医药股份有限公司提供，批号:1708001S，用纯净水配制成相应浓度混悬药液，4 ℃冰箱保存备用。

1.4动物分组、造模及干预 将48只大鼠随机分为空白组、模型组、补佳乐组与补肾益气和血方低、中、高剂量组，每组8只。空白组每天9:00和16：00分别灌胃生理盐水15 mL/kg，连续21 d。其余5组每天9:00给予雷公藤多苷50 mg/kg灌胃,连续21 d；16：00模型组给予生理盐水15 mL/kg灌胃，补佳乐组给予补佳乐0.2 mg/kg灌胃，补肾益气和血方低、中、高剂量组分别给予4.31 g/kg、8.62 g/kg、17.25 g/kg补肾益气和血方灌胃(根据文献[4]中“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算给药剂量，低、中、高剂量分别为临床等效剂量的0.5倍、1倍和2倍)，给药体积均为12 mL/kg，每周称大鼠体重调节给药量，连续21 d。于灌胃第4天起，每天9:00行阴道细胞学涂片，观察动情周期变化情况，全部大鼠皆出现动情周期紊乱，可确定造模成功。

1.5检测指标及方法

1.5.1一般情况 实验过程中观测大鼠体重、饮食、活动、动情周期。

1.5.2血清性激素水平 灌胃结束后于大鼠间情期腹主动脉取血，常温下静置30min，然后将其3 000 r/min离心，分离血清，-20 ℃保存。ELLSA法测定FSH、LH、E2、AMH水平，具体操作严格按试剂盒说明进行。

1.5.3卵巢指数 处死各组大鼠，剖腹取双侧卵巢，称重，计算卵巢指数。卵巢指数(%)=卵巢重量/体重×100%。

1.5.4卵巢组织病理形态 取双侧卵巢，10%福尔马林固定，24 h内梯度乙醇脱水，石蜡包埋，连续做厚5 μm的切片，HE染色，显微镜下观察大鼠卵巢组织形态(各级卵泡、黄体、闭锁细胞、颗粒细胞、间质等)。

1.5.5卵巢组织中VEGF及其受体蛋白表达情况采用免疫组织化学法测定：卵巢烤片脱蜡，采用0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲溶液(125 ℃，103 kPa)进行抗原修复，自然冷却后，置于3% H2O2中以消除内源性过氧化物酶的活性；置于0.5% BSA中，湿盒孵育30 min，PBS洗3次后滴加一抗(1∶200比例稀释)，湿盒孵育，4 ℃孵育过夜。次日从冰箱中取出放置室温下30～40 min复温，滴加MaxVision二抗，湿盒孵育，室温下放置20～30 min。DAB染色，苏木素复染，脱水，中性树胶封片，显微镜下观察染色程度，Lecia Applaction Stiue图像系统采集分析样本，细胞胞质出现淡黄色或黄色颗粒状着色为阳性表达, 摄像记录后采用IPP 6.0软件在同等条件下检测每张组织切片中的VEGF及其受体flt-1、kdr蛋白表达的积分吸光度(IA)值。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 灌胃结束后，模型组、补佳乐组大鼠较空白组毛色黯淡、形体消瘦，个别大鼠表现出精神萎靡不振，反应迟钝；补肾益气和血方低剂量组大鼠饮食量略减少，补肾益气和血方中、高剂量组大鼠上述症状不明显。 空白组大鼠动情周期正常；模型组大鼠动情周期明显延长，动情间期延长至3～5 d；补肾益气和血方低、中剂量组大鼠动情周期稍延长，动情间期延长至2～3 d；补佳乐组和补肾益气和血方高剂量组大鼠的动情周期为5～6 d。

2.2各组大鼠血清性激素水平 与空白组比较，模型组血清FSH水平和FSH/LH均明显增高(P均<0.05)，血清E2、AMH水平均明显降低(P均<0.05)；与模型组比较，补肾益气和血方中、高剂量组FSH水平和补肾益气和血方高剂量组FSH/LH均明显降低(P均<0.05)，补肾益气和血方中、高剂量组和补佳乐组血清E2、AMH水平均明显升高(P均<0.05)；补肾益气和血方中、高剂量组FSH水平明显低于补佳乐组(P均<0.05)，补肾益气和血方高剂量组E2水平与补佳乐组比较差异无统计学意义(P>0.05)，补肾益气和血方低、中剂量组E2水平明显低于补佳乐组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清FSH、FSH/LH、E2、AMH水平比较

2.3各组大鼠卵巢指数 空白组、模型组、补佳乐组和补肾益气和血方低、中、高剂量组大鼠卵巢指数分别为(0.080±0.004)%，(0.067±0.008)%，(0.075±0.011)%，(0.069±0.010)%，(0.076±0.009)%，(0.078±0.007)%，模型组明显低于空白组(P<0.05)，补佳乐组和补肾益气和血方中、高剂量组均明显高于模型组(P均<0.05)；补佳乐组明显高于补肾益气和血方低剂量组(P<0.05)，但与补肾益气和血方中、高剂量组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.4各组大鼠卵巢组织形态学表现 空白组卵巢皮、髓质结构清晰，可见各级卵泡，卵泡形态、数量正常;颗粒细胞层次多，卵泡液含量多;黄体数目较多，且胞浆丰富，色泽鲜艳；间质未见炎细胞浸润及纤维化，血管丰富。模型组卵巢萎缩，各级卵泡数均明显减少，趋于闭锁卵泡较多;颗粒细胞层数少;部分黄体坏死，间质大多有不同程度的炎细胞浸润，未见纤维化。补佳乐组各级卵泡减少，但仍有发育良好的卵泡，闭锁卵泡增多。补肾益气和血方低剂量组各级卵泡减少，颗粒细胞层次少但较模型组多，卵泡液含量少;黄体数目减少，见少量闭锁卵泡。补肾益气和血方中、高剂量组病理形态与空白组基本相似。见图1～6。

图1 空白组大鼠卵巢组织病理HE染色表现(×100)

图2 模型组大鼠卵巢组织病理HE染色表现(×100)

图3 补佳乐组大鼠卵巢组织病理HE染色表现(×100)

图4 补肾益气和血方低剂量组大鼠卵巢组织病理HE染色表现(×100)

图5 补肾益气和血方中剂量组大鼠卵巢组织病理HE染色表现(×100)

图6 补肾益气和血方高剂量组大鼠卵巢组织病理HE染色表现(×100)

2.5各组大鼠卵巢组织中VEGF及其受体蛋白表达情况 与空白组比较，模型组大鼠卵巢组织中VEGF及flt-1、kdr蛋白表达积分吸光度值均明显降低(P均<0.05)，其中阳性表达细胞数和着色程度以kdr最为明显；与模型组比较，补肾益气和血方各剂量组和补佳乐组大鼠卵巢组织中VEGF及flt-1、kdr蛋白表达积分吸光度值均明显升高(P均<0.05)，补肾益气和血方各剂量组和补佳乐组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2及图7～12。

表2 各组大鼠卵巢组织中VEGF及其受体flt-1、kdr蛋白表达积分吸光度值比较

图7 空白组大鼠卵巢组织中kdr阳性表达情况(×200)

图8 模型组大鼠卵巢组织中kdr阳性表达情况(×200)

图10 补肾益气和血方低剂量组大鼠卵巢组织中kdr阳性表达情况(×200)

图11 补肾益气和血方中剂量组大鼠卵巢组织中kdr阳性表达情况(×200)

图12 补肾益气和血方高剂量组大鼠卵巢组织中kdr阳性表达情况(×200)

3 讨 论

中医学中无卵巢储备功能下降病名，关于该病的论述主要见于“月经过少”“闭经”等疾病中。中医理论认为肾精肾气旺盛、冲任气血充足是维持女性生殖功能的根本，若肾精不足，冲任气血衰竭会直接影响卵巢储备功能。该病以肾精亏虚为发病根本，故治疗以补肾为中心。现代研究也证实，补肾中药可提高不孕患者的卵巢储备力，提高受孕率[5]。补肾益气和血方运用熟地、菟丝子、补骨脂、龟板胶、鹿角胶补肾填精为君，肾藏精气，精血互生；肾虚日久, 致瘀血形成，新血不生，故辅以黄芪、党参、山萸肉、山药益气健脾和当归、川芎、益母草养血活血，以减轻先天肾精的耗损。

雷公藤对生殖功能有较为明显的抑制作用，育龄妇女长期服用雷公藤可导致月经紊乱、月经量减少，甚至闭经。高慧等[6]和李琰珉等[7]研究表明，雷公藤对动物卵巢受损害的病理结果与人类更为一致。本实验采用雷公藤多苷灌胃建立卵巢储备功能下降大鼠模型，结果显示造模后模型组大鼠动情周期明显延长，卵巢指数明显降低，说明造模成功。

FSH、LH水平是反映卵巢储备功能的间接指标，FSH/LH比值升高预示卵巢储备功能降低、卵巢低反应[8]。E2是在FSH的作用下，由窦状卵泡产生，随着卵泡库存的减少，E2水平逐渐降低，从而导致FSH升高，因此可作为监测卵巢储备力的直接指标[9]。AMH随年龄增加而下降，其是具有调控卵泡生长和发育的重要标志物[10]。AMH开始表达于窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞，随着卵泡进一步发育而逐渐消失，有闭锁迹象的卵泡表达减少直至消失，这种表达方式说明AMH在始基卵泡募集与优势卵泡选择方面起重要作用[11]。AMH可抑制颗粒细胞对FSH的敏感性，从而在优势卵泡选择中发挥作用[12]。颗粒细胞减少或功能减退则AMH分泌减少，从而加速卵泡的募集与耗竭，最终导致卵巢功能过早衰竭。本实验结果显示，与模型组比较，补肾益气和血方中、高剂量组FSH水平和补肾益气和血方高剂量组FSH/LH均明显降低，补肾益气和血方中、高剂量组血清E2、AMH水平和补肾益气和血方高剂量组卵巢指数均明显升高；补肾益气和血方中、高剂量组FSH水平明显低于补佳乐组，补肾益气和血方高剂量组E2水平与补佳乐组比较差异无统计学意义。提示补肾益气和血方可通过下调FSH水平和提高AMH水平改善低雌激素状态，调节卵巢功能，尤其补肾益气和血方高剂量组效果明显。

卵巢内血管结构和微循环血流是维持卵泡生长、类固醇激素分泌及卵泡对促性腺激素敏感性的重要因素[13]。VEGF是最主要的血管生成调节因子之一，它只有和特异性受体结合后才能发挥其生物学功能。目前发现的VEGF受体有4种，其中flt-1、Flk-1/kdr是研究最多的受体。在某些病理情况下，flt-1 的作用是诱导VEGF与kdr结合，从而发挥VEGF促血管形成的生物学作用[14]。kdr与配体VEGF结合后介导内皮细胞的增殖、分化以及血管的形成过程和血管的通透性，是血管发生和构建的主要调节者[15]。本实验结果显示，模型组大鼠卵巢组织中VEGF及其受体flt-1、kdr蛋白表达积分吸光度值明显低于空白组，其中kdr阳性表达细胞数和着色程度最为明显；补肾益气和血方各剂量组和补佳乐组VEGF及其受体flt-1、kdr蛋白表达积分吸光度值均明显高于模型组，补肾益气和血方各剂量组和补佳乐组比较差异均无统计学意义。表明补肾益气和血方能促进VEGF及其受体flt-1、kdr蛋白的表达，促进新生血管构建和生成，对卵巢组织血管损伤具有一定的保护和修复作用。

综上所述，补肾益气和血方一方面可通过降低血清FSH和FSH/LH比值，提高E2、AMH水平改善大鼠卵巢储备功能减退；另一方面可通过促进卵巢组织细胞内血管的新生，改善卵巢血供，从而维持各级卵泡的生长发育，防止卵泡过早耗竭，其机制可能与促进VEGF及其受体蛋白的表达有关。本研究为补肾益气活血中药进一步防治卵巢储备功能减退提供了一定理论依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。