基于LC－MS／MS研究补肾化瘀生新方在大鼠体内的入血成分*

刘雪曼，张金生，张宝霞

1.河南中医药大学，河南 郑州450046；2.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州450008；3.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州450000

补肾化瘀生新方由熟地黄、巴戟天、川芎、当归、石斛、肉桂、甘草等7味中药组成，具有补肾活血、化瘀生新的功效。前期研究表明，补肾化瘀生新方协同静脉注射骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可延缓衰老，有抗衰防衰的作用［1］，其延缓细胞衰老的作用可能与降低β－半乳糖苷酶活性、激活端粒酶活性、提高BMSCs增殖分化能力有关［2］。

中药及其复方成分复杂多样，认为被吸收入血的成分有可能产生药效［3－4］。本文在前期研究基础上，采用血清药物化学研究方法，应用液相色谱－串联质谱（LC－MS／MS）技术分析补肾化瘀生新方的吸收入血成分，以期探讨其药效物质基础和作用。

1 材料

1.1 动物SPF级SD大鼠40只，雄性，6～8周龄，体质量（200±10）g，购于河南省实验动物中心，动物合格证号：41003100006978。饲养于河南中医药大学第三附属医院实验动物中心，温度18～22℃，湿度30%～60%，明暗周期各12 h，自由采食、饮水。本实验经河南中医药大学伦理委员会批准，并按照相关要求严格执行，伦理批号：DWLL2018030051。

1.2 药物与试剂补肾化瘀生新方：熟地黄12 g（批号：181101）、巴戟天10 g（批号：181001）、肉桂3 g（批号：180801）、石斛10 g（批号：180801）、川芎15 g（批号：180801）、当归12 g（批号：181101）、甘草3 g（批号：181001），上述中药均购于安徽三义堂中药饮片有限公司，并经河南中医药大学药学院崔瑛教授鉴定。对照品：阿魏酸（批号：CHB180206）、梓醇（批 号：CHB181129）、地 黄 苦 苷（批 号：CHB180129）、大黄素甲醚（批号：CHB180730）、黄芩苷（批号：CHB190115）、甲基异茜草素（批号：CHB190120），纯度均≥98%，均购自成都克洛玛生物科技有限公司；甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司，货号：A452－4）；甲酸（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司，货号：85174）。

1.3 仪器Orbitrap Fusion、Xcalibur质谱工作站、SPD2010－230 SpeedVac离心浓缩仪、Heraeus Multifuge X1R型高速台式冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific公司）；BE－3100型超级混匀小精灵（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；XH－C旋涡混合器（金坛市国旺实验仪器厂）；十万分之一电子天平（METTLER TOLEDO公司）；Milli－Q处理纯净水（Millipore公司）；Thermo Accucore C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）；Mass Frontier 6.0工作站。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 补肾化瘀生新方溶液的制备熟地黄、巴戟天、当归、川芎、肉桂、石斛、甘草等7味中药，加12倍量水煎煮提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，浓缩，备用。

2.1.2 对照品溶液的制备取阿魏酸、黄芩苷、梓醇、地黄苦苷、甲基异茜草素、大黄素甲醚各对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，定容配置成0.01 g·L－1的对照品溶液备用。

2.2 动物给药与含药血清样品采集将40只大鼠随机分为空白组和给药组，每组20只。根据前期实验结果［2］，给药组以122.9 g·kg－1的剂量给大鼠灌胃补肾化瘀生新方，空白组灌胃等体积的蒸馏水，早晚各1次，连续给药7 d，第7天下午末次给药后麻醉，腹主动脉取血，室温静置30 min后，离心半径12 cm、3 500 r·min－1离心15 min，取 血 清，用0.22μm过滤器无菌过滤，标记，－80℃保存备用。

2.3 血清样本的处理血清样品置于室温下解冻后，取100μL血清样品，加入3倍量的甲醇，涡旋30 s，1 500 r·min－1混悬10 min，12 000 r·min－1离心10 min，取上清液，45℃下干燥2 h，残渣用200μL甲醇复溶，涡旋30 s，1 500 r·min－1离心10 min，取上清，12 000 r·min－1离心10 min，取上清，进样分析。

2.4 质谱与色谱条件

2.4.1 质谱条件电喷雾离子源（ESI），DMSS2模式，正、负离子分别扫描，扫描范围：m／z 120～1200。喷雾电压3 500（＋）／2 500（－）伏，离子传输管温度300℃，自动增益控制目标：4.0e5，最大注入时间50 ms。

2.4.2 色谱条件Thermo Accucore C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm），以甲醇（A）和0.1%甲酸水（B）为流动相，流速0.2 mL·min－1，梯度洗脱（0.00～5.00 min 95%→55%B，5.00～14.00 min 55%→37%B，14.00～26.00 min 37%→10%B，26.00～34.00 min 10%→0%B，34.00～35.00 min 0%B），柱温30℃，进样量5μL，检测波长254 nm。

2.5 补肾化瘀生新方中入血成分的鉴定应用LC－MS／MS技术，对大鼠灌胃补肾化瘀生新方后的含药血清、空白血清及对照品溶液进行对比分析，应用Xcalibur软件以精确m／z提取离子峰以确定保留时间，运用Mass Frontier 6.0工作站匹配特征碎片离子，结合文献相关信息，鉴别化合物结构，确定入血成分。

2.6 补肾化瘀生新方中入血成分的浓度测定取阿魏酸、黄芩苷、梓醇、地黄苦苷、甲基异茜草素、大黄素甲醚各对照品溶液适量，按一定比例用甲醇由高到低配制成6个浓度梯度的混合对照品溶液，分别进样分析，记录对应峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算样品浓度。

2.7 统计学方法使用Excel 2010软件对实验数据进行归纳、整理，应用SPSS 21.0软件进行线性回归分析。

3 结果

3.1 补肾化瘀生新方入血成分的鉴定最终鉴定出补肾化瘀生新方的入血成分6个，见表1。其中来源于熟地黄的化学成分2个，分别是地黄苦苷、梓醇；来源于巴戟天的化学成分2个，分别是大黄素甲醚、甲基异茜草素；来源于当归的化学成分为黄芩苷；阿魏酸主要来源于当归或川芎；其中代表性成分地黄苦苷、大黄素甲醚提取离子流色谱图，见图1。

表1 6个化学成分鉴定结果

3.2 测定补肾化瘀生新方在大鼠体内的入血成分浓度经LC－MS／MS分析，补肾化瘀生新方入血成分中阿魏酸、黄芩苷、梓醇、地黄苦苷、甲基异茜草素、大黄素甲醚6个化学成分的浓度。见表2。

图1 对照品（a）、含药血清（b）的代表性成分LC－MS／MS色谱图

表2 6个化学成分体内浓度

4 讨论

中药复方的药效物质基础及作用机制研究是中医药现代化发展的核心问题［5－6］，因中药复方所含化学成分复杂多样，其所属化学成分并非复方内单味药物化学成分的简单组合，而是复方中各味中药间共同作用的结果。补肾化瘀生新方由7味中药组成，所含化学成分繁杂。本实验采用血清药物化学研究方法，应用LC－MS／MS技术分析空白血清与含药血清，快速分离并寻找药物入血成分，通过对入血成分进行分析最终确定梓醇、地黄苦苷、甲基异茜草素、大黄素甲醚、黄芩苷、阿魏酸6个化合物为补肾化瘀生新方大鼠体内吸收入血成分。

药理研究表明，阿魏酸通过刺激血管内皮生长因子、PDGF和HIF－1α显示出血管生成活性，其血管生成作用可通过调控MAPK和PI3K途径发生，是缺血性疾病的潜在新治疗剂［7－9］。低浓度的阿魏酸通过上调SIRT1、SIRT7和MDM2蛋白表达发挥神经保护、增殖作用，高浓度的阿魏酸可诱导神经分化和神经突起生长［10］。地黄苦苷对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用，其机制可能与抑制过氧化亚硝酸盐介导的有丝分裂激活有关［11］。黄芩苷可抑制炎症反应、抗氧化应激、保护线粒体、促进神经元保护因子表达、抑制细胞凋亡和坏死，从而发挥对脑缺血大鼠的脑保护作用［12－15］。梓醇可抑制肿瘤坏死因子－α、白细胞介素－6的水平，从而改善机体微炎症状态［16］，通过上调大鼠大脑皮质神经生长因子、脑源性神经营养因子及其基因的表达，促进缺血性病灶周围神经元轴突生长，使芽生轴突形成新的突触连接，增强突触结构可塑性，从而促进神经元存活、修复再生，加速神经功能恢复［17－18］。研究发现，梓醇可通过调节细胞内Ca2＋稳态、降低线粒体损伤、抑制ERK1／2和PARP－1激活进而抑制细胞凋亡，保护细胞免受缺血缺氧性损伤，具有延缓衰老作用［19－21］。甲基异茜草素通过抑制破骨细胞的形成、分化和骨吸收功能来减少骨质丢失［22－23］，另还具有抗炎、免疫调节的作用［24］。研究发现，肾精不足小鼠与肿瘤小鼠的基因表达谱存在相似性，主要体现在细胞分化、细胞周期调节及细胞功能等，这为临床应用补肾填精法治疗癌症提供了借鉴［25］。巴戟天具有补肾阳、壮筋骨、祛风湿功效，其中有效成分大黄素甲醚具有广泛抗癌作用［26］，可抑制多种癌细胞系的生长，如鼻咽癌、肝癌、乳腺癌等，作用机制可能与诱导细胞凋亡与自噬、阻断细胞周期进程、抑制癌细胞转移有关［27－30］。

经与文献对比及前期化学成分研究，认为6个入血成分主要来源于熟地黄、巴戟天、当归、川芎，提示这4味中药可能对补肾化瘀生新方在体内发挥药效起主要作用。6个化合物分属于环烯醚萜苷类、蒽醌类、黄酮类及有机酸类，提示这些成分可能是该方发挥药效的物质基础。在后续研究中，课题组将会进一步探讨入血成分的生物活性，以便更好地探究补肾化瘀生新方的药效物质基础及作用机制。