长期施肥对黄棕壤细菌多样性的影响

刘东海，乔 艳，李双来，陈云峰，张 智，李 菲，胡 诚*

（1 湖北省农业科学院植保土肥研究所，湖北武汉 430064；2 农业农村部武汉黄棕壤生态环境重点野外科学观测试验站，湖北武汉 430064）

土壤微生物是土壤生态系统的重要组分[1]，其参与土壤有机质的降解、腐殖质形成和养分转化循环等过程，是反映土壤环境的重要敏感指标[2-3]。目前土壤微生物高通量测序技术已经成熟，比传统的土壤微生物研究方法成本低[4]，可批量直接测序土壤微生物基因，提高了测序通量，丰富了试验研究的信息量，使土壤微生物研究更为深入。

长期施肥可改变土壤理化性质和生物活性，影响作物产量[5]及土壤微生物群落多样性[6]。Geisseler等[7]利用来自世界各地64项长期试验的107个数据集的分析显示，不同的作物管理措施、土壤环境及长期施用无机肥料等对土壤微生物的影响差异很大；Geisseler等[8]对水稻系统研究的文献综合分析得出的结论类同。目前针对黄棕壤的研究集中在产量、土壤理化性质和CO2等方面[9-11]，关于黄棕壤微生物多样性的研究较少。因此以农业农村部武汉黄棕壤生态环境重点野外科学观测试验站连续35年的长期定位施肥的黄棕壤为研究对象，利用高通量测序技术，探索在稻麦轮作制度下，长期不同施肥管理模式对土壤微生物多样性的影响，以了解土壤的长期培肥效应，为提高黄棕壤土地生产力和可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在农业农村部武汉黄棕壤生态环境重点野外科学观测试验站进行，基地位于湖北省武汉市洪山区湖北省农业科学院南湖试验站 (北纬30º28′，东经114º25′)，本区为北亚热带向中亚热带过渡的地理气候带，光照充足、热量丰富、无霜期长、降水充沛。年平均日照时数为2080 h，日平均气温 ≥ 10℃的总积温为5190℃，年降雨量1300 mm左右，年蒸发量1500 mm，无霜期230～300 天。土壤类型为黄棕壤发育的黄棕壤性水稻土，属潴育水稻土亚类，黄泥田土属。地形是垄岗平原，海拔高度20 m。提水灌溉，排灌方便。

试验于1981年水稻生长季开始，试验前耕层土壤 (0—20 cm) 的主要性状为：有机质 27.40 g/kg、全氮 1.80 g/kg、全磷 1.00 g/kg、全钾 30.20 g/kg、碱解氮 151.00 mg/kg、铵态氮 9.40 mg/kg、有效磷 5.0 mg/kg、速效钾 98.50 mg/kg、pH 6.30。

1.2 试验设计

试验共设5个处理：不施肥对照 (CK)；氮磷钾化肥 (NPK)；常量有机肥 (OM)；氮磷钾+常量有机肥 (NPK+OM)；氮磷钾+高量有机肥 (NPK+OMM)。供试化肥为尿素 (N46%)、磷酸一铵 (N 10%、P2O546%)、氯化钾 (K2O 60%)，每年施用量为纯 N 150 kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O 150 kg/hm2，N∶P2O5∶K2O=1∶0.5∶1。有机肥料为鲜猪粪，堆置田头一周腐熟后施用，其含水量 69%、C 282.1 g/kg、N 15.1 g/kg、P2O520.8 g/kg、K2O 13.6 g/kg (干基)。常规施用量为鲜猪粪 11250 kg/hm2，高量施用量为鲜猪粪 18750 kg/hm2，耕作制度为一年两熟，水稻–小麦轮作，水稻和小麦化肥施用量分别占全年施肥量的60%和40%，有机肥施用量各占50%。水稻和小麦季磷钾肥均采用移栽或播种前一次基施，氮肥施用水稻为基施40%、分蘖肥40%、穗肥20%；小麦为基肥50%、腊肥（冬季肥）25%、拔节肥25%。

1.3 样品采集

试验于2016年10月水稻收获后采集土壤样品，采样深度为0—20 cm，每个小区9点采样，剔除石砾和植物残根等杂物后混合，然后装入已消毒的自封袋中，放入冰盒中带回实验室。每个小区的混合土样分为两部分，一部分用于化学指标测试，另一部分放置于–80℃冰箱保存，用于DNA提取和高通量测序。

1.4 试验方法

土壤碱解氮用碱解扩散法，有效磷用紫外可见分光光度法，速效钾用火焰光度法，有机碳用重铬酸钾法，土壤pH采用1∶2.5的土水比—复合电极测定[12]。

土壤总 DNA 采用 E.Z.N.A Soil NDA Kit (Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.) 提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组NDA。对16S rRNA基因的V3～V4高变区片段进行PCR扩增，引物序列为338F (5′– ACTCCTACGGGAGGC AGCAG–3′)和806R (5′–GGACTACHVGGG TWTCTAAT–3′)。扩增条件为：95℃ 预变性 2 min；接着 95℃ 变性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，进行25个循环；循环结束后72℃最终延伸5 min。每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒 (AXYGEN公司) 切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2%琼脂糖凝胶电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTMST蓝色荧光定量系统 (Promega公司) 进行检测定量，按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。在上海美吉生物医药科技有限公司的Illumina Miseq PE300平台分别进行细菌测序。

1.5 数据统计及分析

采用单因素方差分析判断各处理水稻产量、土壤理化性质和细菌群落α多样性，多重比较采用最小显著差数法 (LSD，P＜0.05)，分析软件为SPSS 20.0 (SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)。利用 R (3.51)分析软件，用“plspm”包做偏最小二乘法路径回归分析 (PLS-PM)，细菌群落结构采用测序后经过抽平处理的OTU数据。运用Canoco 5.0 软件做细菌群落与环境因子间的冗余分析 (RDA)。

2 结果与分析

2.1 土壤基础化学性质和产量

长期不同施肥对土壤基础化学性质影响显著(表1)。与CK相比，施肥处理可显著增加土壤碱解氮、有效磷、速效钾和有机碳含量 (P＜0.05)。单施有机肥和有机无机肥配施能够维持pH稳定，长期单施NPK降低了土壤pH。与NPK处理比较，OM、NPK+OM和NPK+OMM处理的碱解氮、有效磷和有机碳含量显著提高；NPK+OM和NPK+OMM处理的速效钾含量显著提高。与OM相比，NPK+OM和NPK+OMM处理的碱解氮和有机碳含量没有显著增加，NPK+OM只显著增加了速效钾含量，而NPK+OMM处理显著增加了有效磷和速效钾含量。与CK处理比较，4个施肥处理均显著提高了水稻产量，但这4个施肥处理间产量无显著差异。

表 1 不同施肥处理土壤化学性质及产量Table 1 Soil chemical property and rice yield under long-term fertilizer treatments

2.2 长期不同施肥土壤细菌群落结构

2.2.1 土壤细菌α多样性变化 不同施肥处理土壤细菌丰富度指数 (Chao)和多样性指数 (Shannon) 如表2所示。长期施肥能够提高细菌群落的丰富度，从大到小排序 OM＞NPK+OM＞NPK+OMM＞NPK＞CK。与NPK处理比较，OM、NPK+OM和NPK+OMM处理Chao指数分别提高了7.61%、3.90%和3.24%，Shannon指数分别提高了2.51%、–0.31%和–1.26%。说明施用有机肥较化肥更有利于提高土壤细菌丰富度，但是长期高量有机肥和无机肥配施(NPK+OMM) 细菌丰富度指数提高的幅度变小，同时多样性指数有所降低。与CK处理相比，OM处理提高了细菌多样性 (2.83%)，NPK和NPK+OM处理维持平衡 (0.31%和0.00%)，NPK+OMM处理降低了细菌群落多样性 (–0.94%)。总的来看，长期单施常量有机肥提高了细菌的丰富度和多样性，但长期高量有机肥和无机肥配施 (NPK+OMM)，细菌多样性有所降低。

表 2 不同施肥处理土壤细菌α-多样性指数Table 2 α-diversity of soil bacteria under long-term fertilizer treatments

相关性分析结果 (表3)显示，长期施肥后水稻产量与土壤碱解氮和土壤有机碳（SOC)含量显著正相关，且土壤SOC含量的增加可显著增加细菌丰富度。碱解氮、有效磷、速效钾、SOC和pH与土壤细菌α-多样性指数 (Shannon) 没有显著相关性，SOC与丰富度指数 (Chao) 显著正相关。

表 3 土壤理化性质与土壤细菌α-多样性指数和产量的相关性Table 3 Correlations of soil chemical properties, bacterial α-diversity indices and yield

2.2.2 长期不同施肥下土壤细菌群落结构变化 偏最小二乘法判别分析 (PLS-DA) 发现，不同施肥处理对细菌群落 (纲水平) 的影响存在显著差异 (图 1)。CK、NPK、OM和有机无机肥配施 (NPK+OM和NPK+OMM) 细菌群落结构形成4个不同的分组，其中CK处理细菌群落结构最松散，组内差异较大，而不同施肥处理都提高了细菌群落的紧密度，尤其NPK+OM和NPK+OMM处理细菌群落结构更接近。

图 1 细菌群落纲水平PLS-DA分析Fig.1 PLS-DA analysis of bacterial community at the class level

细菌门水平群落组成主要是绿弯菌门 (19.22%～31.20%)、变形菌门 (19.87%～25.89%)、放线菌门(14.53%～21.31%)、酸杆菌门 (13.63%～15.59%)、硝化螺旋菌门 (6.11%～8.33%)和芽单胞菌门 (2.23%～3.27%)，共占群落组成比重的88.73%～91.41% (图2a)。图2b显示，细菌纲水平群落组成主要是放线菌纲(14.53%～21.31%)、酸杆菌纲 (13.63%～15.59%)、厌氧绳菌纲 (6.85%～16.14%)、硝化螺旋菌纲(6.11%～8.33%)、α-变形菌纲 (4.67%～7.85%)、β-变形菌纲 (3.67%～5.20%)、δ-变形菌纲 (9.73%～12.09%)、绿弯菌纲 (1.82%～4.37%)、芽单胞菌纲(2.23%～3.27%)、γ-变形菌纲 (1.03%～2.04%)。

图 2 不同处理土壤细菌在门和纲水平上的类群组成Fig.2 Soil bacterial composition at the levels of phylum and class under different treatments

与 CK 比较，单施化肥 (NPK)、有机肥 (OM) 或者有机无机肥配施 (NPK+OM和NPK+OMM) 处理均提高了土壤 α-变形菌纲 (13.35%～67.93%)、β-变形菌纲(4.89%～41.76%)和γ-变形菌纲(16.61%～98.28%) 的相对丰度，降低了绿弯菌门的厌氧绳菌纲 (7.00%～57.53%)和绿弯菌纲(27.61%～58.25%) 相对丰度；NPK处理降低了放线菌纲 (8.20%)和硝化螺旋菌纲 (7.37%)相对丰度，提高了酸杆菌纲 (13.02%)相对丰度。OM、NPK+OM和NPK+OMM处理分别提高了放线菌纲相对丰度34.62%、29.61%和0.38%，OM、NPK+OM和NPK+OMM处理的酸杆菌纲相对丰度基本无变化(–0.89%～1.81%)；OM降低了硝化螺旋菌纲(18.81%) 相对丰度。

与NPK处理比较，OM处理显著提高了变形菌门中的 α-变形菌纲 (48.15%)、β-变形菌纲 (32.26%)、γ-变形菌纲 (70.03%)和放线菌纲 (46.65%) 相对丰度，显著降低了绿弯菌纲 (41.97%)和厌氧绳菌纲(53.99%) 相对丰度；NPK+OM和NPK+OMM处理相应的细菌相对丰度则变化不显著。与NPK+OM处理比较，NPK+OMM处理分别降低了放线菌纲(22.55%)和α-变形菌纲相对丰度 (5.93%)，提高了厌氧绳菌纲 (31.42%)、绿弯菌纲 (49.91%)和硝化螺旋菌纲 (30.04%) 相对丰度。

2.3 土壤性质对土壤细菌群落结构的影响

环境因子影响黄棕壤水稻土细菌群落 (纲水平)（图3）。RDA分析的第一轴和第二轴解释度合计31.85%，说明在水稻季，除SOC、有效磷 (AP)、碱解氮 (AN)和pH等环境因子外，还有其他的土壤性质影响细菌群落结构。pH与细菌群落结构 (路径系数=–0.48)和多样性 (路径系数=–0.16) 负相关，而SOC、有效磷、碱解氮和速效钾则显示正相关。

图 3 土壤细菌群结构和土壤理化性质的RDA分析Fig.3 Redundancy analysis of the correlation between soil chemical properties and bacterial community structure

为了更好地研究土壤理化指标、细菌群落结构、细菌多样性以及产量的相互关系，构建了偏最小二乘路径模型 (PLS-PM，图4)。拟合优度(goodness-of-fit)为0.615，模型拟合度较好。结果显示土壤理化指标中的SOC、碱解氮、有效磷和速效钾对细菌群落结构正调控 (路径系数=0.36)，pH 对细菌群落结构负调控 (路径系数=–0.48)；但是土壤理化指标中SOC、碱解氮、有效磷和速效钾对细菌多样性的调控较小 (路径系数=0.24)。调控产量的理化指标主要是SOC、碱解氮和有效磷。土壤细菌多样性对产量显示正调控 (路径系数=0.42)。

图 4 最小二乘路径模型分析Fig.4 Directed graph of the partial least squares path model (PLS-PM)

3 讨论

3.1 土壤理化性质对长期施肥的响应

长期不同施肥对土壤化学性质产生了显著影响。与CK相比，施肥处理能显著增加土壤碱解氮、有效磷、速效钾和有机碳含量，与以往对水稻土的研究结果[13-14]一致。施肥显著提高水稻产量，最小二乘路径模型分析显示理化指标与产量正相关 (路径系数=0.47)，但施肥处理间差异不显著；与其他施肥处理相比，长期NPK+OMM处理水稻产量出现降低趋势，最小二乘路径模型分析显示土壤细菌群落多样性与产量正相关 (路径系数=0.42)，因此土壤细菌群落多样性或许可作为产量评估的参考指标。

3.2 土壤细菌多样性对长期施肥的响应

本研究发现，施肥处理间细菌α多样性差异不显著，与前期研究[2,15-16]在水稻土上施用无机肥料和有机肥对细菌群落α多样性的影响较小的结论一致。土壤pH是影响细菌群落的重要因素[17-18]，偏最小二乘路径模型分析显示pH与细菌群落结构负相关(路径系数=−0.48)，但是施肥处理间pH没有显著差异。相关性分析、冗余分析 (RDA)和偏最小二乘路径模型分析都显示土壤理化指标对细菌多样性的影响小，可能是由于水稻季水分因素对微生物群落的影响[19]。本研究NPK+OMM处理高量粪肥投入细菌多样性较其他施肥处理有下降的趋势，与Liu等[20]的研究结论一致。单施化肥或有机无机肥配施均能提高土壤细菌群落丰富度，与陆海飞等[21]的研究结论相同，但长期大量有机无机肥配施促进共营养生物的生长，同时导致细菌多样性的降低，进而可能导致生态系统不稳定[22]。

3.3 土壤细菌群落组成对长期施肥的响应

本研究长期不施肥 (CK)、施用NPK以及有机肥(OM、NPK+OM和NPK+OMM) 处理土壤细菌群落结构存在显著差异，其中NPK+OM和NPK+OMM处理细菌群落结构更为接近，证实了长期施用不同肥料土壤中的细菌群落结构会发生显著变化[22-23]；Shen等[24]指出施用有机肥的土壤细菌群落结构紧密聚集，与本研究未施用有机肥和施用有机肥的土壤细菌群落结构明显不同的结论一致。可能因为有机粪肥 (猪粪) 中含有的丰富的细菌类群为厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门，施入土壤引起土壤细菌群落结构变化[23]。

本研究中黄棕壤性水稻土细菌门水平群落组成主要是绿弯菌门、变形菌门、放线菌门和酸杆菌门，与Wang等研究的有关水稻土细菌群落的结论[15-16,25]一致。本研究中，与CK 比较，施肥处理提高了α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲的丰度，尤其OM处理显著提高它们的丰度。α-变形菌在碳循环中具有重要的作用[26-27]，能够利用难降解的碳源并降解为中间小分子物质，为其它微生物提供养分，因此可能导致OM处理的细菌多样性最高；同时OM处理α-变形菌纲丰度高，有助于改善土壤肥力，甚至有助于植物生长[28]。CK处理绿弯菌门的厌氧绳菌纲和绿弯菌纲相对丰度最高，而绿弯菌门中大多数物种都是严格的厌氧菌[29-30]，侧面反映CK处理土壤氧含量不足，而根际氧的缺乏会导致养分矿化速率减小，影响了根系对养分的吸收[31]，进而间接影响作物产量。与CK 比较，单施有机肥和有机无机肥配施均降低了绿弯菌门的厌氧绳菌纲和绿弯菌纲丰度，提高了放线菌丰度，尤其OM处理变化最显著，与Liu等[20]指出的长期施用粪肥显著促进变形菌和放线菌的生长结论一致。放线菌具有高度通用的降解能力，并在土壤碳矿化中起关键作用[32-33]，促进作物生长。NPK处理显著提高了酸杆菌纲丰度，而单施有机肥和有机无机肥配施处理酸杆菌纲丰度基本无变化。酸杆菌跟土壤的pH存在一定的正相关关系[27,34]，证实了施用NPK会降低土壤pH。NPK+OMM处理提高了硝化螺旋菌纲丰度，硝化螺旋菌是氮循环微生物群落的关键组成部分[35]，负责将亚硝酸盐氧化为硝酸盐[36]，硝酸盐向下移动，在水稻土厌氧层中经过反硝化作用转化为分子氮 (N2)，从而降低了氮的利用效率[37]，可能因此间接导致NPK+OMM处理水稻产量较低。

4 结论

在试验期限内，养分投入足够的条件下，单施化肥、单施有机肥或者化肥有机肥配施尚没有对水稻产量产生显著的影响，但土壤速效养分和有机碳含量发生了显著的变化。施肥没有显著改变土壤pH，与单施化肥相比，单施有机肥或者有机无机肥配施显著提高了土壤有机碳和碱解氮含量，有机无机肥配施还显著提高了有效磷和速效钾含量。各施肥处理土壤细菌α多样性无显著差异，但细菌群落结构差异显著。单施有机肥处理土壤α-变形菌纲和放线菌纲相对丰度最高，绿弯菌门的厌氧绳菌纲和绿弯菌纲以及硝化螺旋菌纲相对丰度最低；单施化肥降低了放线菌纲和硝化螺旋菌纲相对丰度，提高了酸杆菌纲相对丰度。与低量有机肥投入相比，高量有机肥投入降低了放线菌纲和α-变形菌纲相对丰度，提高了厌氧绳菌纲、绿弯菌纲和硝化螺旋菌纲相对丰度。偏最小二乘路径模型 (PLS-PM) 结果显示土壤理化指标中的SOC、碱解氮、有效磷和速效钾对细菌群落结构具有正调控，pH为负调控，但都对细菌多样性的调控较小。土壤SOC、碱解氮、有效磷和细菌多样性对产量具有正调控作用。