稻壳炭对紧实土壤中苹果根系硫同化酶活性、H2S含量及根系构型的影响

田孝志，徐龙晓，宋建飞，荀 咪，张玮玮，杨洪强

（山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）

土壤紧实度过高是影响作物生长发育的重要因素之一。多年生果树在栽培后很少进行土壤深翻，并且在病虫防治和花果管理过程中还会受到踩踏和碾压等，这使果园土壤紧实问题已越来越严重[1]。

土壤紧实度过高不仅破坏土壤原有生态平衡[2-3]，还会抑制根系生长，削弱根系对营养元素的吸收和代谢[4]。硫是植物的必需营养元素，不仅参与植物生长发育，还参与植物对逆境胁迫的响应[5]。硫酸盐被根系吸收后，通常先经ATP硫酸化酶 (ATP-sulfurylase，ATPS) 活化生成腺苷 5′-磷酰硫酸 (adenosine-5'-phosphosulfate，APS)，APS经还原和转化后，在丝氨酸乙酰转移酶 (serineacetyltransferase，SAT)和O-乙酰丝氨酸裂解酶[O-acetylserine(thiol)lyase，OASTL]等的催化下转化为半胱氨酸 (Cys)，Cys可进一步转化为甲硫氨酸、硫苷和谷胱甘肽等，并可被L/D-半胱氨酸脱巯基酶 (L/D-cysteine desulphydrase，L/DCD) 催化生成硫化氢 (H2S)，这些中间产物不仅满足植物体的营养需求，还能够减轻干旱等胁迫所导致的氧化损伤等[6-9]。活跃的硫代谢对植株正常生长发育必不可少，缺硫会抑制番茄ATPS和OASTL活性以及H2S的生成，降低植株硫代谢和作物生长[10]；苹果根系硫代谢水平和H2S的生成还明显受土壤紧实胁迫抑制等[11]。

生物炭是生物质在低氧条件下的高温裂解产物，合理施用生物炭能够改善土壤结构，提高土壤孔隙度和养分有效性，促进根系生长发育和养分吸收等[12-14]，但其效果因用量和原料而不同。比如，1%的秸秆炭和1%的炭化苹果枝能够改善根系生理功能[15-16]；1%的稻壳炭可提高太湖滨岸土壤氮磷养分和土壤微生物量，而2%～5%的稻壳炭就会引起土壤磷素淋失[17]；1%的稻壳炭还显著提高稻米中硫、磷、钙、镁等元素含量等[18]。生物炭在正常土壤中的效果和作用已基本明确，但紧实土壤和正常土壤的结构和理化性状不同，稻壳炭对紧实土壤中根系形态及根系硫代谢的作用有待进一步研究。此外，正常情况下，生物炭通过降低土壤紧实度而发挥作用，但施入生物炭而仍维持土壤原有紧实状态的情况下是否还有效? 目前尚不清楚。

苹果是世界四大水果之一，明确土壤紧实胁迫下苹果根系变化和硫代谢特征，探讨减轻土壤紧实胁迫的途径和方法，对于果园土壤管理和调控苹果根系生长及养分吸收有重要意义。稻壳炭是常用生物炭，本研究以不同砧木的苹果幼树为对象，分析稻壳炭对紧实土壤中苹果根系形态构型和根系硫代谢的影响，重点探讨稻壳炭在土壤原有紧实度状态下的作用效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验植株为2年生‘红富士’苹果幼树，砧木分别为平邑甜茶 (Malushupehensisvar.pingyiensisJiang)和八棱海棠 (MalusrobustaRehd)，计作‘红富士’苹果/平邑甜茶和‘红富士’苹果/八棱海棠；试验土壤有机质10.05 g/kg、速效氮91.70 mg/kg、有效磷 75.98 mg/kg、速效钾 107.29 mg/kg、全硫 528.42 mg/kg、水溶性硫70.30 mg/kg、吸附性硫46.67 mg/kg、盐酸可溶性硫 82.11 mg/kg和pH 6.5；稻壳炭中全硫、水溶性硫、吸附性硫和盐酸可溶性硫含量分别是 58.47、9.50、4.80、9.96 mg/kg；试验用盆高 24 cm、直径 35 cm。

1.2 试验设计

试验于2019年3—7月在山东泰安国家苹果工程技术研究中心苹果试验站和山东省高校果树生物学重点实验室进行。2019年4月中旬将苹果幼树移至盆中，填入上述土壤，用木夯用力镇压为紧实土壤 (compacted soil，CS) 处理；同时，按照质量比将1%的稻壳炭均匀混入土壤填入盆中后移植苹果幼树，用木夯将盆土镇压至与“紧实土壤”处理相近的容重，作为“紧实土壤+稻壳炭”(compacted soil+rice husk biochar，CS+RHB) 处理；以未进行镇压的盆栽土壤作为“正常土壤”(normal soil，NS)，按照质量比将1%的稻壳炭均匀混入土壤填入盆中后移植苹果幼树，轻度镇压作为“正常土壤+稻壳炭”(normal soil+rice husk biochar，NS+RHB)。灌水洇实后第5天测定土壤物理参数和氧气浓度，正常土壤和紧实土壤混入稻壳炭，经镇压和灌水洇实后土壤紧实度和容重没有明显变化，紧实土壤孔隙度和氧气浓度在添加稻壳炭时提高 (表1)。每个处理3次重复，处理第60 天取样测定相关指标。

表 1 不同处理下的土壤物理参数和氧气浓度Table 1 Soil physical parameters and oxygen concentrations under different treatments

1.3 试验方法

采用根钻法采集盆中部土样及根系，选取盆中部距根系2 cm以内的土壤作为根区土样，风干后过1.00 mm (18目)筛备用；根系洗净吸干表面水分后用于后续的指标测定。

土壤中不同形态硫参考Balík等[19]的方法采用分级提取：用去离子水提取水溶性硫，提取水溶性硫后的土样残渣用0.032 mol/L NaH2PO4溶液提取吸附性硫，之后的土壤残渣用2 mol/LHCl溶液提取盐酸可溶性硫，最后将各待测液用硫酸钡比浊法测定。

土壤紧实度用TJSD-750-11土壤紧实度仪 (浙江托普云农科技股份有限公司) 测定；土壤氧气浓度使用 Microx 4 trace 便携式光纤测氧仪 (慧诺瑞德科技有限公司) 测定。土壤孔隙度通过测定土壤比重和土壤容重计算得到。

根系活力和根系参数测定：根系活力采用赵世杰等[20]的方法测定；根系形态构型参数经根系扫描仪得到图像后用万深LA-S系列图像分析，根长密度指单位土壤体积内根系总长度 (单位：cm/cm3)。

硫代谢相关指标测定：根系硫酸根含量采用硫酸钡比浊法测定；根系内源H2S含量参考Sekiya等[21]的方法测定；ATPS活性参考Lappartient等[22]的方法测定；OASTL活性参考Bloem等[23]的方法测定；L-CD、D-CD活性参考Riemenschneider等[24]的方法测定。

1.4 数据分析

用 Microsoft Excel 2016 进行数据整理，用 SPSS 23.0软件进行数据计算以及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 稻壳炭在紧实土壤中对苹果根区不同形态硫含量的影响

土壤中的硫主要以无机硫的形式被根系吸收，根据萃取剂的不同，无机硫分为水溶性硫、吸附性硫和盐酸可溶性硫，但能够被根系吸收的主要是前两类[25]。由表2可见，无论苹果砧木是八棱海棠还是平邑甜茶，紧实土壤 (CS) 中的苹果根区水溶性硫含量均显著低于正常土壤 (NS)，吸附性硫含量则显著高于正常土壤。可见，土壤紧实增加了土壤胶体对水溶性硫的吸附，显著提高苹果根区土壤吸附性硫含量，而使土壤水溶性硫含量显著下降。

表 2 不同处理苹果根区土壤不同形态硫含量 (mg/kg)Table 2 Contents of different forms of sulfur in apple root-zone soil under different treatments

在正常土壤中加入稻壳炭，苹果根区土壤水溶性硫和盐酸溶解性硫均有所提高。在紧实土壤中添加稻壳炭处理，根区土壤水溶性和盐酸溶解性硫含量显著高于没有添加稻壳炭处理，其中，以八棱海棠和平邑甜茶为砧木的根区土壤水溶性硫含量CS+RHB处理比CS处理分别高出10.93%和12.24%，盐酸可溶性硫含量分别高出11.07%和9.66%。土壤吸附性硫含量没有受到稻壳炭的明显影响，这可能与稻壳炭本身的吸附选择性有关。

2.2 稻壳炭对苹果根系硫酸盐含量的影响

图1显示，两种砧木八棱海棠和平邑甜茶苹果根系硫酸盐含量紧实土壤处理 (CS) 均比在正常土壤处理 (NS) 显著降低，根系硫酸盐含量分别降低了64.48%和64.51%，八棱海棠砧木根系硫酸盐含量降低幅度小于平邑甜茶砧木。

图1还显示，无论在正常土壤还是在紧实土壤中加入稻壳炭均提高了根系硫酸盐含量。在正常土壤加入稻壳炭的处理，以八棱海棠和平邑甜茶为砧木的根系硫酸盐含量分别提高了5.50%和4.01%；在紧实土壤中加入稻壳炭的处理，八棱海棠和平邑甜茶为砧木根系硫酸盐含量分别提高了73.58%和41.30%。可见，在两种土壤情况下，八棱海棠砧木根系硫酸盐含量的提高幅度均大于平邑甜茶，在两种苹果砧木中，根系硫酸盐含量的提高幅度为CS+RHB处理大于NS+RHB，这说明稻壳炭的加入对紧实土壤中硫的可吸收性有更大的作用。

图 1 稻壳炭对苹果根系硫酸盐含量的影响Fig.1 Effects of rice husk biochar on root sulfate content of apple tree

2.3 稻壳炭在紧实土壤中对苹果根系ATPS和OASTL活性的影响

由图2可见，苹果根系ATPS和OASTL活性在紧实土壤 (CS) 中均显著降低，以八棱海棠和平邑甜茶为砧木的根系ATPS活性分别降低了52.95%和54.14%，根系OASTL活性分别降低了62.29%和69.19%，两者在以八棱海棠为砧木的根系中的降低幅度小于以平邑甜茶为砧木。

由图2还可知，在加入稻壳炭土壤仍维持原来紧实状态的情况下，正常土壤 (NS)和紧实土壤 (CS)中稻壳炭均使苹果根系ATPS和OASTL活性提高。其中，在正常土壤中加入稻壳炭处理比没有添加处理 (NS)，八棱海棠和平邑甜茶根系ATPS活性分别提高11.02%和4.32%，OASTL活性分别提高8.63%和4.27%；在紧实土壤中加入稻壳炭处理(CS+RHB) 比没有添加处理 (CS) 在八棱海棠和平邑甜茶根系ATPS活性分别提高40.09%和38.69%，OASTL活性分别提高68.81%和50.69%。可见，无论在正常土壤还是在紧实土壤中加入稻壳炭后，八棱海棠砧木中ATPS和OASTL活性提高幅度均大于平邑甜茶；在紧实土壤加入稻壳炭处理CS+RHB两种砧木苹果根系ATPS和OASTL活性提升幅度均大于在正常土壤加入稻壳炭的处理。这说明在紧实土壤加入稻壳炭比在正常土壤中能更有效地促进根系对硫酸根的活化和同化。

图 2 稻壳炭对苹果根系ATPS和OASTL活性的影响Fig.2 Effects of rice husk biochar on root ATPS and OASTL activity of apple tree

2.4 稻壳炭在紧实土壤中对苹果根系L-CD、DCD活性及H2S含量的影响

由图3可见，土壤紧实显著降低苹果根系L-CD、D-CD活性及H2S含量，在八棱海棠和平邑甜茶砧木根系中，L-CD活性分别下降41.41%和55.56%，D-CD活性分别下降62.86%和63.72%，H2S含量分别下降59.31%和67.26%，它们在八棱海棠砧木的苹果根系中的下降幅度均小于在平邑甜茶砧木中。

图 3 稻壳炭对苹果根系L-CD、D-CD活性及H2S含量的影响Fig.3 Effects of rice husk biochar on root L-CD, D-CD activity and H2S content of apple tree

同ATPS和OASTL活性变化一样，在维持紧实状态不变的情况下，无论是正常土壤还是紧实土壤，加入稻壳炭后，苹果根系L-CD、D-CD活性及H2S含量均有提高 (图3)。其中，正常土壤加入稻壳炭处理 (NS+RHB)，在以八棱海棠和平邑甜茶为砧木的苹果根系L-CD活性分别提高16.28%和10.50%，D-CD活性分别提高8.62%和5.20%，H2S含量分别提高10.69%和6.48%；在紧实土壤中添加稻壳炭处理 (CS+RHB)，在以八棱海棠和平邑甜茶为砧木的苹果根系L-CD活性、D-CD活性和H2S含量分别提高35.32%和30.43%、66.64%和54.54%、40.81%和31.55%。可见，不论是在正常土壤还是紧实土壤中添加稻壳炭，以八棱海棠为砧木的根系L-CD、D-CD活性及H2S含量的提高幅度比在平邑甜茶为砧木的根系更大；在紧实土壤中添加稻壳炭，八棱海棠和平邑甜茶根系L-CD、D-CD活性及H2S含量提高幅度均大于在正常土壤加入稻壳炭。H2S是重要的信使分子，能够增强植物的抗胁迫能力[6-9]；土壤紧实度过大也会对根系造成胁迫，在紧实土壤中添加稻壳炭促进H2S生成，必然有利于提高根系的抗胁迫能力。

2.5 稻壳炭在紧实土壤中对苹果根系活力和根系生长的影响

由图4可见，在紧实土壤 (CS) 中苹果根系活力、根干重和根长密度均被显著抑制，以八棱海棠和平邑甜茶为砧木的根系活力分别降低37.29%和42.90%，根干重分别减少33.55%和36.41%，根长密度分别减少39.64%和41.37%，以八棱海棠为砧木的苹果根系中的降幅均小于以平邑甜茶砧木的。

在土壤紧实状况不变时，在正常土壤和紧实土壤中添加稻壳炭，苹果根系活力、根干重和根长密度均有显著增加 (图4)。正常土壤添加稻壳炭处理(NS+RHB)，在八棱海棠和平邑甜茶为砧木的苹果根系活力、根干重和根长密度分别提高4.85%和5.03%、10.32%和7.97%、2.00%和4.89%；紧实土壤添加稻壳炭处理 (CS+RHB)，两种砧木八棱海棠和平邑甜茶的苹果根系活力、根干重和根长密度分别增加35.98%和12.37%、50.16%和33.33%、19.58%和15.67%。由上可见，在紧实土壤中添加稻壳炭，以八棱海棠为砧木的苹果根系活力、根干重和根长密度增加幅度比平邑甜茶为砧木大；在紧实土壤中添加稻壳炭，两种砧木苹果根系活力、根干重和根长密度增加幅度比在正常土壤添加稻壳炭的提高幅度大。即稻壳炭对紧实土壤中的根系生长和代谢有更强的促进作用，这与2.4部分稻壳炭通过促进根系H2S生成而增强抗胁迫能力的结果是一致的。

图 4 稻壳炭对苹果根系活力、根干重和根长密度的影响Fig.4 Effects of rice husk biochar on root activity，root dry weight and root length density of apple tree

2.6 稻壳炭在紧实土壤中对苹果根系形态构型的影响

根系分形维数是反映根系结构复杂程度和根系分支情况的重要指标，根系分形维数越大代表着根系结构和根系分支越复杂[26]。表3显示，土壤紧实均显著降低了两种砧木苹果根系的总长度、根系体积和根系分形维数，在八棱海棠和平邑甜茶砧木中分别降低39.65%和41.37%、39.09%和43.00%以及24.53%和24.67%，在平邑甜茶中的降幅稍大一些。

表3还显示，在正常土壤和紧实土壤中加入稻壳炭，在维持土壤紧实状况前后不变的情况下，所测苹果根系形态构型参数均有提高，但在正常土壤添加稻壳炭处理 (NS+RHB) 的提高程度较小，而紧实土壤添加稻壳炭处理 (CS+RHB) 提高程度较大，两种砧木均如此。其中，紧实土壤掺入稻壳炭处理(CS+RHB)，两种砧木八棱海棠和平邑甜茶的苹果根系总长度、根系体积和根系分形维数比没有掺入稻壳炭 (CS) 分别增加19.58%和15.68%、18.37%和17.23%、20.83%和20.35%，在八棱海棠中的增加幅度均大于在平邑甜茶中。说明稻壳炭的加入对以八棱海棠为砧木的苹果根系生长和根系构型有更突出的效果。

表 3 稻壳炭对苹果根系形态构型参数的影响Table 3 Effects of rice husk biochar on root parameters of apple tree

3 讨论

良好的土壤环境是根系正常生长的基本条件，重度紧实显著降低土壤通气性，增加物理机械阻力，必然会限制植物根系生长发育[27-29]。生物炭作为土壤改良剂，其特殊的孔隙结构吸附固定土壤养分，不仅减少养分淋溶和流失，还能够改善土壤结构，促进根系对养分的吸收，这已在正常土壤中得到广泛证实[30-32]。由于生物炭质地疏松、比重小，在紧实土壤中掺入生物炭会使土壤由紧实变得疏松，土壤容重和紧实度会明显下低，这自然会增加土壤孔隙度，改善土壤结构。土壤孔隙度主要取决于土壤的紧实状况，紧实度越大，孔隙度越小。本试验发现，加入稻壳炭后，即使土壤保持在原来相近的紧实状态，土壤孔隙度依然提高。可见，此时的土壤孔隙度并非土壤紧实状态决定的，而是稻壳炭的影响。稻壳炭含有大量的小空隙和微空隙，与正常土壤相比，添加了稻壳炭的土壤在镇压至紧实状态时，大量的土壤空隙被挤压，但稻壳炭中的微空隙还存在，因此，即使处于相同紧实度状态下，添加稻壳炭的土壤会比未添加稻壳炭的土壤具有更高的孔隙度 (表1)，孔隙度提高必然会增大土壤的容氧量，提高土壤氧气浓度。由于根系吸收和同化养分需要消耗由呼吸作用产生的ATP等能量，土壤氧气浓度提高有利于增强根系的呼吸作用，从而可以产生更多能量，进而能够促进包括硫素在内的养分吸收和同化代谢，根系硫酸盐含量和硫代谢相关酶的活性也相应提高 (图1～图3)。而加入稻壳炭的正常土壤对苹果根系生长和硫代谢的提升幅度要小于掺入稻壳炭的紧实土壤，也正说明了这一点。由于正常土壤中气体环境已经满足苹果根系的正常生长，其本身的有效孔隙和容氧量已经较高，加入稻壳炭后难以发挥稻壳炭微孔结构带来的积极作用，因此，对苹果根系生长以及硫酸盐代谢提升幅度相对较小。

根系对土壤无机盐的主动吸收和被动吸收，明显受根系活力和根长密度影响。土壤紧实和稻壳炭的加入均显著影响了苹果根系活力和根长密度 (图4)，这必然会改变根系硫酸盐和土壤水溶性硫酸盐含量(图1和表2)，进而影响根系对硫酸盐的吸收和同化代谢。根系吸收的硫酸盐除部分以原有形态转运外，其它的主要经过硫代谢途径被同化。ATPS和OASTL是硫代谢的关键酶，其活性反映了硫元素在植物体内同化代谢的强弱[8,33]；H2S是硫代谢的中间产物，与植物抗逆性和信息传递密切相关[6,9]。土壤过于紧实对植物是一种逆境胁迫，必然会抑制根系硫代谢，本研究不仅进一步证实了这一点，而且发现即使在土壤保持原来的紧实状态和容重下，稻壳炭仍然可以提高根系硫代谢酶活性和内源H2S含量，这说明稻壳炭不仅能够通过降低土壤紧实度发挥作用，也能够在土壤紧实度不变的条件下，对土壤和根系产生影响，也就是说，即使不解除紧实胁迫，稻壳炭也能够缓解紧实胁迫对苹果硫代谢和根系生长的抑制，生物炭对土壤和根系的效应并不仅仅依赖于土壤紧实度和容重的改变。

平邑甜茶和八棱海棠都是优良的苹果砧木，都具有发达根系和较强的抗逆性，但两者对胁迫的抵抗能力并不一样，这自然会影响到以它们为砧木的苹果根系对环境的响应。曹慧等[34]发现八棱海棠对干旱胁迫的抵抗和耐性强于平邑甜茶，刘飞等[35]发现八棱海棠对锌营养胁迫的耐性比平邑甜茶强，最近有报道八棱海棠相比平邑甜茶具有较强的耐镉能力[36]，这些结果表明，八棱海棠对逆境胁迫的抵抗力和耐性均强于平邑甜茶。本试验发现，以八棱海棠为砧木的苹果根系硫代谢酶活性、内源H2S生成以及根系生长等受土壤紧实胁迫的抑制程度小于以平邑甜茶为砧木。分形维数是反映根系结构的重要参数[26]，本试验还发现，以八棱海棠为砧木的苹果根系在土壤紧实胁迫下呈现更高的分形维数，根系结构更为复杂，分支更多，这进一步表明八棱海棠对紧实胁迫有更强的耐受性。同时，在紧实土壤中加入稻壳炭后，以八棱海棠为砧木的苹果根系硫代谢水平及根系生长的提升幅度要高于以平邑甜茶为砧木，说明紧实胁迫下的八棱海棠根系生长和硫代谢更易被稻壳炭所缓解。

4 结论

在不改变土壤容重和紧实状态的情况下，施加稻壳炭能够显著增加根系密度和生物量，改善根系构型，提高根系硫代谢酶活性并促进H2S生成，在紧实土壤中的效果比在正常土壤中的更明显。土壤紧实度和稻壳炭对苹果根系硫代谢和根系生长的影响程度因砧木而异，以八棱海棠为砧木的苹果根系对紧实胁迫有更强的耐受性，所经受的紧实胁迫也更易被稻壳炭缓解。