山银花不同萃取部位抗炎、抗氧化体外活性评价及化学成分分析

周 峰，颜扬礼，黄 凯，赵康宏，谢红旗,*

（1.湖南农业大学园艺学院，湖南长沙 410128；2.中兽药湖南省重点实验室，湖南长沙 410128；3.湖南省邵阳市隆回县农业农村局,湖南邵阳 422000）

《中国药典》（2005 版）将灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.）、红腺忍冬（L.hypoglaucaMiq.）、华南忍冬（Lonicera confusaDC.）或黄褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或带初开的花归属于山银花，山银花在中医临床中常被用于治疗如痈、溃疡、关节痛等病征[1]。目前，山银花在我国广泛应用于食品、茶饮、药品、保健品、化妆品等各方面[2]，其具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、保肝利胆等作用[3-5]。

山银花是一味拥有悠久历史的传统大宗药材，具有清热解毒、疏散风热的功效[6]，自2015 年被列入药食同源中药材目录[7]，其可作为功能食品的属性逐渐受到重视，人们对山银花药理药性以及活性成分的进一步研究具有重要意义。近年研究发现，山银花中含有大量绿原酸和皂苷类成分[8]，且绿原酸具有抗炎、抗氧化等药理活性[9-10]。肖作为等[11]对不同产地的山银花进行抗氧化研究，发现山银花醇提物具有良好的抗氧化活性，其中灰毡毛忍冬的抗氧化活性最强。其多糖提取物对DPPH、-OH 和O2-自由基也有较强清除率[12]。李泮霖等[13]通过山银花对细胞内促炎因子的调控作用研究，表明山银花对各炎症因子的调控作用均具有显著差异。目前对山银花药理活性的研究表明，山银花具有显著的抗炎和抗氧化活性，但未建立完善的细胞模型对其抗氧化活性进行研究，且未对其具有抗炎、抗氧化活性的物质基础进行研究。基于山银花具有抗炎与抗氧化活性的物质基础并不明确的基础上，随山银花应用越来越广泛，对花活性物质基础的研究是必不可少的。

因此，本文通过脂多糖（LPS）诱导的细胞炎症模型和H2O2诱导的细胞氧化应激模型对山银花各萃取部位进行抗炎和抗氧化性评价，并基于UPLC-QTOF-MS 对具有显著活性的部位进行化学成分分析，旨在为阐明山银花具抗氧化、抗炎活性的物质基础提供理论依据，并为山银花的进一步开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山银花鲜品 由湖南省鸿利药业有限公司提供，并经湖南农业大学园艺学院曾建国教授鉴定为灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.）；乙腈（色谱纯）、甲醇、石油醚、三氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯、二甲基亚砜（DMSO,分析纯) 国药集团（上海）化学试剂有限公司；DMEM 培养基、1640 培养基、胎牛血清（FBS）、2,7-二氢二氯荧光黄（DCFHDA）赛默飞世尔科技公司；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽酶（GSH）和生化检验试剂盒 南京建成生物工程有限公司；白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）美国Proteintech 公司；脂多糖（LPS）美国Sigma 公司；RAW264.7 和RIN 细胞 由湖南农业大学国家中医药管理局亚健康干预技术实验室提供。

1290 超高压液相色谱串联6545 四级杆飞行时间质谱 安捷伦科技有限公司；XS205 分析天平METTLER TOLEDO 国际贸易有限公司；MB-530 多功能酶标分析仪 深圳市汇松科技发展有限公司；SCIENTZ-18N 冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；DHP-500 电热恒温培养箱 北京市永光明医疗仪器有限公司；HUP-UV 超纯水机上海禾工科学仪器有限公司。

1.2 山银花各萃取物的制备

山银花干燥打粉后，过 40 目筛，根据文献 [14]方法稍加改动，称取 100 g 干粉，加入 2 L 甲醇，并于40 ℃下超声提取 30 min，重复两次，合并滤液，将所得提取液减压浓缩至浸膏状，保留部分样品制成冻干粉备用，取剩余浸膏加入超纯水 250 mL，使其充分溶解，依次采用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇逐级萃取 3～5 次，直至有机层无色，合并有机层，加入少量超纯水，将每萃取部位减压浓缩至无刺激性气味，制成冻干粉备用。各层所得冻干粉分别标注为：甲醇总提取液-T1，水饱和正丁醇萃取部分-T2，乙酸乙酯萃取部分-T3，三氯甲烷萃取部分-T4，石油醚萃取部分-T5。

1.3 各萃取部位对炎症因子的影响

1.3.1 供试品溶液的配制 将1.2 中所得样品用DMSO 分别配制成 100 mg/mL 的储存液，加药时用DMEM 培养基稀释成终浓度为50 μg/mL。

1.3.2 细胞培养 RAW264.7 细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养，置37 ℃、5% CO2并饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期进行传代，2～3 d 传代 1 次，取第3 代细胞用于实验。

1.3.3 各萃取部位对 RAW264.7 细胞生长的影响 细胞消化后，使细胞密度为1×105/mL，按每孔100 μL接种至96 孔培养板，至培养箱培养24 h，待细胞良好贴壁生长，随机分为对照组、加入冻干粉（50 μg/mL）的试验组、LPS 模型组，分别换入新的培养基及含药物培养基，每组设3 个复孔，处理24 h，按每孔10 μL加入CCK-8 试剂溶液后继续置于培养箱中培养2 h，取出孔板，避光，于摇床上轻轻摇晃 3～5 min 后，于450 nm 处进行检测。

1.3.4 各炎症因子的检测 供试品溶液的配制同1.3.1。取对数生长期的 RAW264.7 细胞进行消化，调整细胞悬液的密度为1×105/mL，按每孔100 μL接种至96 孔培养板，于含 5% CO2、37 ℃、饱和湿度条件的培养箱中培养 24 h，待细胞贴壁生长后，随机分为对照组、LPS（1 μg/mL）组、LPS（1 μg/mL）+冻干粉（50 μg/mL）组，每组设3 个复孔，继续培养 24 h，取上清液用于肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子的检测，并使用胰酶消化细胞，收集细胞沉淀用于NO 的检测。

1.4 各萃取部位对细胞氧化应激的影响

1.4.1 细胞培养 RIN-m5F 细胞培养于含10% FBS的1640 培养基中，2～3 d 换一次培养液，细胞汇合率达90%左右，待细胞汇合至90%，去除旧的培养基，使用PBS 清洗一遍后，加入1 mL 胰酶，消化30 s至细胞轻微脱落，移除胰酶，换入2 mL 新的培养基，将细胞打散混匀，并转移1 mL 至新的培养瓶，完成细胞传代。

1.4.2 H2O2诱导的RIN 细胞氧化损伤的抗氧化作用 以H2O2处理的细胞组为对照组，取对数生长期的RIN-m5F 细胞，胰酶消化后用完全培养基轻轻吹打成单细胞悬液，调整细胞悬液密度为1×105/mL，按每孔100 μL 接种至96 孔培养板，培养24 h，取对数生长的细胞进行分组处理，见表1：

使用DCFH-DA 荧光探针测定山银花各萃取部位的细胞内ROS 水平。细胞培养、分组及处理如上，按照1:1000 用无血清培养液稀释DCFH-DA，在37 ℃孵育20 min。然后用无血清细胞培养液洗涤收集细胞，使用流式细胞仪检测。用无血清细胞培养基洗涤细胞并收集，通过流式细胞仪检测收集的细胞。购买测定试剂盒，取上清液根据试剂盒使用说明，使用酶标仪对超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽酶（GSH）等因子的检测。

1.5 UPLC-Q-TOF-MS 法鉴定化学成分

1.5.1 样品前处理 取1.2 中水饱和正丁醇和乙酸乙酯萃取部位冻干粉各10 mg，加入甲醇配制成溶液浓度为1.0 mg/mL。

1.5.2 色谱条件 色谱柱为：Agilent-ZORBAX SBC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），DAD 检测器，流动相为0.1%甲酸水（A）～乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序：0～15 min，5%～30% B；15～20 min，30%～45% B；20～30 min，45%～90% B。柱温35 ℃，进样量5.0 μL，流速0.3 mL/min。

1.5.3 质谱条件 通过优化质谱条件，采用负离子模式电喷雾电离离子源（ESI-），TOF 质量扫描范围m/z 100～3000；载气温度300 ℃，流速8 L/min；雾化压力35 psi；鞘气温度350 ℃，流速11 L/min；毛细管电压3500 V；碰撞诱导解离电压175 V，设置能量梯度为15、20、25、30 eV。

1.6 数据处理

采用Origin 2018 进行数据处理及绘图；本文所用数据平行及3 组重复次数、所有的统计学方差分析（ANOVA）、差异性分析（Paired-Sample T Test）均采用SPSS 23.0 软件，结果均表示为：平均值±标准偏差（SD）。

2 结果与分析

2.1 抗炎活性评价

2.1.1 不同萃取部位对细胞活性的影响 用山银花各萃取部位处理RAW264.7 细胞24 h，结果如图1所示，与空白组相比，山银花各萃取部位在处理浓度为50 μg/mL 时，对RAW264.7 细胞株的生长无明显影响，说明该浓度可用于后续细胞实验。

图1 各萃取部位处理对细胞存活率的影响Fig.1 Effect of each extraction part treatment on cell survival rate

2.1.2 抗炎活性检测结果 炎症反应是由多种化学因子共同参与调节的，与其具有最密切联系的炎症介质与炎症因子是NO、TNF-α 和IL-6。NO 可由多种细胞产生，是炎症和细胞毒性反应中一个重要的介质，参与多种炎症信号传导，能与多种炎症因子相互作用，其过量分泌能增强其他炎症因子的生物活性，加重炎症反应[15]。TNF-α 是炎症初期最早出现的炎症因子，主要由巨噬细胞分泌，能促进炎症的发生与发展[16]。IL-6 由淋巴细胞和某些非淋巴细胞（如成纤维细胞、内皮细胞等）产生，是一种参与机体应激反应和免疫调节的重要细胞因子，它又被称为B 细胞刺激因子，具有增强免疫、促进造血、诱导B 细胞和T 细胞增殖分化等作用[15]。

因此，本试验评价山银花甲醇溶液提取物及其各萃取部位（50 μg/mL）对LPS 刺激的RAW264.7细胞中各抗炎因子（NO、TNF-α 和IL-6）的影响，在LPS 刺激RAW264.7 细胞的炎症反应中，山银花甲醇提取液中各萃取部位对LPS 刺激RAW264.7 细胞释放NO、TNF-α 和IL-6 均具有不同程度的抑制作用，显示了较好的体外抗炎活性，其中乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取部位对各炎症因子的影响较显著。水饱和正丁醇萃取部位对LPS 刺激RAW264.7细胞释放NO、TNF-α 和IL-6 的抑制作用分别是66.40%、13.14%、79.66%，乙酸乙酯萃取部位对LPS 刺激RAW264.7 细胞释放NO、TNF-α 和IL-6的抑制作用分别是50.97%、16.39%、74.19%。因此，水饱和正丁醇萃取部位处理浓度为50 μg/mL 时对RAW264.7 细胞炎症因子的抑制能力相对更强，具体结果见表2。

表2 不同萃取部位对LPS 诱导的细胞NO、TNF、IL6 含量的影响Table 2 Effects of each extract site on production of NO,TNFα,and IL-6 in LPS-stimulated RAW264.7 cells (x ± s,n =3)

2.2 抗氧化活性评价

2.2.1 RIN-m5F 细胞ROS 检测结果 ROS 是指化学性质活泼的具有含氧基团的化合物。ROS 过度增加或持续存在可对细胞形成氧化应激，造成多种损伤。H2O2是研究ROS 的重要工具，H2O2可以迅速穿过细胞膜，通过反应产生更多的ROS，常用于模拟ROS 对 RAW264.7 巨噬细胞的氧化损伤[17]。经山银花各萃取部位（50 μg/mL）处理后（如图2 所示），均能显著性降低细胞内H2O2诱导的ROS 的含量，山银花甲醇溶液提取物及水饱和正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚等四个萃取部位处理可分别降低RIN 细胞内62.17%、69.34%、86.19%、78.67%、77.72% ROS 的含量，其中乙酸乙酯萃取部位作用效果最强。

图2 ROS 荧光统计图Fig.2 Fluorescence statistical chart of ROS

2.2.2 RIN-m5F 细胞中抗氧化因子的检测结果 细胞内存在完善的抗氧化防御体系，如超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX、过氧化氢酶CAT 等，能够直接清除自由基，使自由基处于动态平衡。经山银花各萃取部位（50 μg/mL）处理后（如图3、4、5 所示），对各抗氧化因子均有一定的提升作用，甲醇溶液总提取物及水饱和正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚等四个萃取部位可使H2O2诱导的RIN 细胞中SOD 浓度分别提高1.58、1.08、2.51、2.20、1.01 倍；使GSH 浓度提高2.43、1.59、4.40、3.69、2.46 倍；使CAT 浓度提高4.93、2.79、8.89、6.43、4.26 倍，其中乙酸乙酯提取部位对抗氧化因子的提升作用最强。

图3 各萃取部位处理对细胞SOD 值的影响Fig.3 Effect of each extract site treatment on SOD of cells

图4 各萃取部位处理对细胞GSH 值的影响Fig.4 Effect of each extract site treatment on GSH of cells

图5 各萃取部位处理对细胞CAT 值的影响Fig.5 Effect of each extract site treatment on CAT of cells

本试验通过脂多糖（LPS）诱导的细胞炎症模型和H2O2诱导的细胞氧化应激模型，结果表明山银花甲醇提取物及各萃取部位均有不同程度的抗炎、抗氧化活性，因此，山银花是一种具有抗炎、抗氧化活性的药食同源中药材。通过山银花甲醇提取部位以及各萃取部位对各炎症因子的影响表明，水饱和正丁醇的抗炎活性最强；对各抗氧化因子的影响表明山银花甲醇提取液中乙酸乙酯萃取部位的抗氧化活性最强。由此推测山银花活性成分极性较大，采用水饱和正丁醇和乙酸乙酯能有效富集，可为提高后续山银花分离纯化效率提供参考依据。但未知具有抗炎、抗氧化活性的物质基础，因此，本试验又通过UPLC-QTOF-MS 分析具有显著活性的萃取部位的化学成分，以期探究其活性物质基础。

2.3 LC-MS 结果与分析

本文通过UPLC-Q-TOF-MS 对水饱和正丁醇和乙酸乙酯萃取部位进行化学成分分析，通过对比两萃取部位总离子流图（TIC）（图6），结果表明，两萃取部位中化学成分存在一定差异，这可能是导致水饱和正丁醇与乙酸乙酯萃取部位抗炎、抗氧化活性存在差异的主要原因。

图6 具显著活性的萃取部位的总离子流图（TIC）Fig.6 The total ions chromatogram (TIC) of extract parts with significant activity

通过二级质谱扫描并结合文献报道及检索Chemspider 数据库对水饱和正丁醇和乙酸乙酯萃取部位所含化合物进行分析，结果表明（如表3 所示），水饱和正丁醇部位主要包含17 种化合物，主要是有机酸类和皂苷类成分；乙酸乙酯部位鉴定了主要的12 种化合物，主要是有机酸类成分。两萃取部位化合物存在含量、数量以及种类上的差异，其中绿原酸、断氧化马钱子苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、1,4-O-二咖啡酰奎宁酸六个有机酸类化合物为共有组分，其余不同组分可能是导致它们出现活性差异的主要原因。抗炎活性较强的水饱和正丁醇部位中主要含有的有机酸类和皂苷类化合物，其中绿原酸被证实是具有抗炎活性的化合物[9]，皂苷类成分是除绿原酸外具有抗炎活性的另一大化合物[29]，这可能是水饱和正丁醇部位抗炎活性较强的原因之一；而抗氧化活性较强的乙酸乙酯萃取部位主要是有机酸类化合物，这类化合物具有极强的抗氧化活性[30]，这可能是山银花具有抗氧化活性的物质基础之一，也可能导致乙酸乙酯萃取部位抗氧化活性较强的原因之一。因此，有机酸和皂苷类化合物可能是山银花具有抗炎、抗氧化活性的物质基础。此外，由于水饱和正丁醇和乙酸乙酯萃取部位对山银花的有机酸和皂苷类化合物可以有效富集，因此本试验也可为提高分离制备的效率提供参考依据。

表3 水饱和正丁醇和三氯甲烷萃取部位所含化合物的LC-MS 分析（负离子模式）Table 3 The LC-MS analysis of the compounds from the extraction parts of water saturated n-butanol and chloroform(negative ion mode)

3 讨论与结论

目前研究表明山银花水提取物和甲醇提取物均具有良好的体外DPPH 清除活性、超氧阴离子清除活性[31]。Zhou 等[32]灰毡毛忍冬各萃取部位抗氧化研究发现，乙酸乙酯部位的体外DPPH 自由基清除活性和还原能力最佳，本文研究结果与之相符，本研究构建体外抗氧化评价细胞模型，为研究者提供科学的体外抗氧化方法，相对真实地反应活性物质的抗氧化能力[33]。

李泮霖等[13]研究发现山银花提取物对香烟烟雾提取物刺激KB 细胞诱导的急性口腔炎症模型具有治疗作用。曾安琪等[34]通过金银花和山银花提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀试验及对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7 细胞炎症模型的抗炎作用，发现两者均有较好的抗炎作用。本文采用[30]脂多糖（LPS）诱导的细胞炎症模型评价了山银花甲醇与不同萃取部位的抗炎活性，表明山银花甲醇提取物具有显著的抗炎活性，不同萃取部位抗炎作用有一定差别，与前人的研究具有相似的结论。

本文通过脂多糖（LPS）诱导的细胞炎症模型和H2O2诱导的细胞氧化应激模型对山银花不同萃取部位进行体外抗炎和抗氧化活性评价，并基于UPLCQ-TOF-MS 对具显著活性的萃取部位进行化学成分分析。结果表明，山银花甲醇提取物及其各萃取部位（50 μg/mL）均有不同程度的抗炎、抗氧化活性。其中水饱和正丁醇萃取部位的抗炎活性最强，对RAW264.7 细胞内NO、TNF-α、IL-6 等炎症因子的抑制率分别达66.40%、13.14%、79.66%，初步鉴定该部位中的17 个有机酸类和皂苷类成分；乙酸乙酯萃取部位的抗氧化能力最强，可对RIN 细胞中抗氧化酶SOD、GSH、CAT 三种抗氧化因子的活性分别提高2.51 倍、4.40 倍、8.89 倍，初步鉴定该部位中的12 个有机酸类成分。结果同时表明，山银花中活性成分的极性偏大，在低极性部位含量较少，采用水饱和正丁醇和乙酸乙酯可以对其有效富集。本文可为进一步揭示山银花具有抗炎、抗氧化等药理活性的物质基础提供理论依据，并为山银花的进一步开发利用提供理论参考。

本文研究结果不能阐明化合物与活性之间具体的量效关系，关于化合物与活性之间的具体量效关系还有待进一步研究。