基于SNP标记的肉产品溯源研究进展

王彦云 杨曙明

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京100081）

肉产品味道鲜美，是最富营养价值的动物性食品之一。随着社会经济的发展和消费结构的改变，肉产品在餐桌上占的比重不断增加。但是由于政府监管不足、企业责任意识欠缺、消费者安全意识薄弱，一些肉产品安全事件给国内行业发展、消费者信心、政府公信力、国际形象等方面造成较大冲击。针对肉产品的加工、生产、销售全过程建立追溯管理体系，是控制肉产品质量安全最常用的方法[1]。追溯体系的建立，有助于从源头有效控制污染的传播范围，将对社会的影响降到最低[1]。对动物个体及产品的追溯管理，是保证食品质量安全、保护消费者合法权益的重要手段[2]。

SNP（single ncleotide polymorphism）， 又名单核苷酸多态性，是基因组水平上单个碱基的变异所引起的DNA序列的多态性，属于第三代遗传标记技术。本文对现有SNP标记在肉产品溯源以及肉类品种溯源方面的研究进行了归纳，有利于今后SNP标记技术在肉产品溯源领域更为广泛的应用。

一、SNP标记及其特点

分子标记（molecular markers）在溯源中是一个非常重要的概念，是DNA水平遗传多态性的直接反映，早在20世纪末就已经被广泛应用于动植物的育种研究、性状与基因的研究。分子标记自诞生之日起不断发展，逐渐应用于肉产品的溯源研究与应用中。动物个体的生长发育，往往会使得其外部形态发生极大的变化；同时，肉产品在加工处理后，也会加大溯源难度。然而，基于分子标记技术的溯源方法不受产品形态的影响，可以逆行对品种个体做到准确鉴定[3～4]。20世纪90年代，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）首次见于人类分子遗传杂志，成为继扩增片段长度多态性（amplified restriction fragment polymorphism，AFLP）和简单重复序列多态性（simple sequence repeat，SSR）之后的第3代遗传标记技术。由于具有存在广泛、遗传稳定性高、富有代表性以及易实现分析的自动化等特点，SNP溯源技术广泛应用于溯源研究[5～7]，已实现在猪肉、羊肉和牛肉等畜禽个体及产品溯源中的成功应用。

（一）数量多且分布广SNP在基因组中存在广泛，可位于基因编码区、基因的非编码区以及基因间区（基因和基因之间）。就人类基因组而言，SNP的总量超过300万个。在哺乳动物中，平均每500～1 000个碱基，就有一个多态性位点，利用基因上以及基因与基因之间广泛存在的SNP位点，可以建立一系列的标记，通过变异位点、变异序列与性状关系的研究，可以对个体和群体间基因上的差异有更深的了解[8～9]。

（二）遗传稳定性高SNP的形成是历史进化的结果，通常来说，先形成的SNP比之后形成的SNP在种群中所占的比率要高。相比于其他分子标记，SNP标记为单核苷酸的突变，且突变频率很低，与一些不良性状也不存在连锁遗传，因此属于可遗传的变异，遗传稳定性高[10～12]。

（三）富有代表性已有研究表明，位于基因内部的某些SNP可能直接影响动物机体蛋白质的合成与表达，通常直接表现为个体差异和种群差异。SNP所含有的这种特性使其在复杂性状研究以及在动物个体鉴定、种间鉴定和产地溯源方面有天然的优势[2]。

（四）易实现分析的自动化自然界中的大部分生物是二倍体。在二倍体生物中，SNP等位基因只有一对，也叫作双等位基因。基于SNP的这种遗传二态性，一个SNP理论上可以区分3种基因型，从而可以对3个动物个体作出鉴定。传统的遗传标记方法，例如限制性片段长度多态性、微卫星，需要对片段的长度作出测量，过程繁琐、工作量大，而SNP检测结果的分析只需要判断结果只是显示为需要＋/－即可。SNP的二态性也有利于进行基因分型和自动化筛选，这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化[13～17]。

二、SNP的开发

要实现DNA分子标记技术在肉产品溯源实践中的应用，需要开发满足要求的SNP。一般来说，SNP的开发方法有两种，一是根据美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）等数据库及文献中已报道的SNP位点，通过群体验证选择标记位点；二是基于性状基因新位点的开发，选择当前文献中已报道的与肉质及体态性状相关基因扩增，并对多样本测序结果进行比对，得到新的SNP位点。

（一）基于数据库和文献的位点开发基于数据库和文献的位点开发是SNP开发的最主要的途径，主要包括3方面内容：（1）位点的挑选。通过NCBI数据库检索，结合参考文献，依据一定标准进行位点的挑选。（2）位点同源性分析。由于一部分位点存在多高同源，即位点所在的基因区段与基因组内其他区段同源性很高。这些位点做PCR检测的时候也都会被扩增出来，影响结果的判读，不适合做高通量测序，因此需要对挑选的位点进行同源性分析，舍去高同源性位点。（3）位点的验证。筛选后的位点，经多重PCR扩增模板，产物纯化后上高通量基因分型平台进行测定，将没有测出的位点剔除，剩下各位点在测试群体中的等位基因频率、基因型频率通过直接计数方式获得[18]。

（二）基于性状基因的位点开发基于性状基因的位点开发，是通过对多样本目的基因的测序结果进行比对，从而发掘新的多态性位点，主要内容包括：（1）目的基因的挑选。通过NCBI等数据库检索及文献报道，选择与研究对象生长性状、肉质性状相关的基因。（2）目的基因的扩增。利用Primer Premier5.0等软件设计通用引物，引物合成后，混合DNA模板确定引物最佳退火温度，同时考察引物扩增效率及特异性，舍去扩增效率低及有杂片段的引物，采用余下引物对包含研究对象样本分别进行PCR扩增。（3）多序列比对。对多样本目的基因扩增产物做Sanger测序，通过SeqMan软件比对多样本相同扩增序列，获得目标样本候选多态性位点。

分子标记的开发是DNA溯源应用的关键，研究表明，分子标记、基因和性状之间存在重要的联系。通过SNP分析方法定位数量性状位点（Quantitative Trait Loci，QTL）的研究，以及分子标记连锁群的构建及其应用，人们对分子标记、基因和性状三者之间的关系有了更加全面的认识。在研究基础上，通过选择感兴趣的目的基因，可以开发更多新的SNP，使得SNP在动植物育种和溯源方面的应用更加广泛。

三、SNP分型检测方法

SNP是单核苷酸突变引起的变异，可以检测单核苷酸突变的的方法均可以用于SNP的鉴定。理想的SNP分型方法应满足5个方面，即对突变位点的检测快速准确；检测成本低，开发时间短；反应体系稳定，样品质量要求低；数据分析简单准确；高通量，自动化[19～20]。SNP分型方法众多，几种主要的SNP检测方法及其适用范围见表1。

SNP作为新一代分子标记技术，因其数量丰富，遗传稳定性高，易于自动化分型等诸多优点，引发了广大研究者的浓厚兴趣，新的高通量的检测方法也不断被开发出来。然而，目前的检测方法还不能完全满足以上要求。未来SNP的检测分型方法应根据适用范围，在更擅长的领域做更精细的提升，如在高通量应用领域，应该更着眼于获得数据的有效性；在中等通量的应用领域，更多考虑到中小型实验及临床应用需求；在现场快速检测领域，应朝着简便、快速、便携式方向发展[9]。

表1 SNP检测方法与适用范围

四、SNP标记在肉产品溯源中的应用

基于SNP标记的肉产品溯源研究由来已久，而且在某些领域的应用已取得成功。用于肉类溯源的SNP标记应用在个体和种群中具有较高的多态性、分布广，且能稳定遗传，检测简单等特点[35～38]。以往SNP标记用于肉产品溯源主要有3个目的：（1）肉类品种的鉴别，即特殊肉产品与普通肉产品的鉴定。（2）个体来源的鉴定。（3）产品产地的鉴别，主要是以种间差异和遗传背景为基础的品种鉴别，如进口肉与本国肉的鉴定。

（一）肉类品种的鉴别DNA技术的发展使得分子方法在传统牛肉溯源中的应用成为可能。近年来，微卫星已成为最常用的标记方法，然而SNPs正在取代它们。近年来，SNP在品种溯源方面的研究众多，并在一些领域取得了很大成功，比如牛、羊、 猪的品种溯源研究[38～39]。

ZHAO等[40]用10个SNP标记鉴定我国市场上的牦牛肉和普通牛肉。随机选取不同品种的牦牛样品和普通牛样品各16份，在普通牛群体中有多态性但在牦牛中为单态性的15个突变位点被确定为SNP候选位点。全部15个SNP候选位点，在16份牦牛样品中均为纯合子，在16份普通牛样品中既有纯合又有杂合。从中选取了10个SNP位点，并设置了一个阳性对照引物对牦牛进行鉴定。牦牛样品一般产生1～3个波峰，普通牛样品在电泳图谱上有5个或5个以上波峰。该方法被成功地应用于一种声称由牦牛制成的产品实际上是一种普通牛肉产品的鉴别。

SASAZAKI等[41]使用SNP标记技术对日本本国牛和进口外国牛进行了溯源研究。日本牛样品446头，包括日本黑牛和日本荷斯坦牛，进口牛样品388头，包括美国牛和澳大利亚牛。按照446头日本牛中，等位特异性基因只存在于进口牛中的标准，严格挑选11个SNP标记，对美国和澳大利亚牛的鉴定概率超过9.60×10－2。进口牛的高特异性使得日本牛和进口牛鉴定的准确度和可信程度得到保障。

NISHIMURA等[42]对日本黑牛、F1（日本黑牛×荷斯坦牛）和荷斯坦牛进行了SNP的溯源研究。使用样本（荷斯坦牛2 590头，日本黑牛1 341头），用牛SNP50K微珠芯片检测了54 001个SNP，筛选了符合标准的SNP35 844个，分别用PCA分析和线性判别分析的方法对其作了分析。结果表明，线性判别法对标记物的判别效果优于主成分分析（principal component analysis，PCA），用这个线性分析式，能将荷斯坦牛与日本黑牛完全鉴定区分出来，然而做不到荷斯坦牛和F1牛的鉴定，在此临界值下，日本黑牛被误判为荷斯坦牛和F1的错误概率<5.79×10－4。与此同时，荷斯坦牛和F1被误判为日本黑牛的错误概率分别<8.00×10－3（F1） 和2.66×10－5（荷斯坦牛）。

KAWAGUCHI等[43]用6个SNP标记鉴别日本本国和牛和澳大利亚和牛。于新加坡13个市场购得143份澳大利亚和牛样品，对47个SNP标记进行分型处理并使用DigiTag2分析，排除识别为来自同一个体的样品，最终确定了不同个体样品130个。6个SNP标记从已有研究中选择[41，44～45]， 根据每个标记的等位基因频率估计，计算被鉴定为澳大利亚和牛的概率，对6个SNP标记的鉴定效果进行评价。由6个SNP标记组成的系统，从日本本国和牛和澳大利亚和牛中鉴定出澳大利亚和牛的概率为77.6%，这个值低于SASAZAKI等[41，44]通过相同6个标记对正常澳大利亚牛的概率计算值9.25×10－1，但可以满足日本本地和牛与澳大利亚和牛鉴定的要求。

（二）个体来源的鉴定传统的动物个体溯源方法采用的是给动物佩戴耳标的方式进行个体信息的记录[46～47]，DNA分子标记溯源技术恰好可以弥补动物耳标及条码技术的不足，一是该技术可以溯源到个体、品种甚至生物种类；二是DNA无法更改，且稳定，加工肉制品仍可获得较高质量的DNA[48～49]。因此，将传统的记录系统与DNA标记技术有机结合，可以真正实现养殖－屠宰－加工－运输－销售的全链条的溯源[50～51]。

吴潇等[52]用18个SNP对我国市场上的猪个体进行鉴定。挑选了我国市场上主要的猪品种共10种、233只（均采自上海崇明富农猪场），对这些猪肉样品进行检测，共发现33个SNP，通过杂合度计算进一步筛选得到6个猪肉DNA溯源SNP，分型方法选用内切酶的方法。这6个猪肉的DNA溯源SNP与张小波等[53]研究发现的12个猪肉DNA溯源SNP一起使用，理论上能鉴定3.87×108只猪个体，可以用于大规模的猪只个体识别和追溯。

ZHAO等[54]使用18个SNP组合，实现对我国市场清真牛个体鉴定和牛肉追溯。实验样品共176个，涵盖我国市场上主要的7个清真牛品种（绝大部分样品牛个体为雄性）。检测并筛选出符合标准的SNP标记59个，运用多重荧光PCR技术，对7个不同品种176个牛个体DNA组中59个SNP进行分型分析。4个SNP未检出弃去，弃去最小等位基因在各自种群中＜20%以及在混合物种中＜30%的SNP位点，最后剩余36个符合标准的SNP。选择多态性最高的18个SNP一起使用，可以实现任意两个清真牛个体被确定为同一个体的概率为7.97×10－10，在相同SNP情况下，鉴定效果好于ORRÙL等[18]的欧洲牛个体鉴定的SNP组合。

（三）产品产地的鉴别产品产地的鉴别，主要依据地理分布差异以及不同遗传背景造成的动物种群差异，利用遗传标记对存在种间差异的动物个体及种群所属产地作一鉴定。

ROGBERG-MUNOZ等[55]基于Illumina MiSeq高通量测序平台对我国黄牛牛肉与进口牛肉混合样本进行基因组测序，利用开发的95个SNP标记对我国黄牛和9个国外品种牛进行聚类分析，本研究使用的方法可以正确区分英国品种和我国本地品种，这为利用SNPs检测我国市场上的外国品种肉类提供了可能性。

黄树文等[56]基于SNP芯片对广东省5个地方猪种作了遗传多样性分析，利用Illumina 60K芯片对大花白猪、梅花猪、蓝塘猪、粤东黑猪进行SNP分型，利用Geenseek 80K芯片对广东小耳花猪进行SNP分型。其中，梅花猪原为大花白猪的1个类群，但其体型外貌与大花白猪差异较大，为便于分析，将大花白猪和梅花猪作为2个不同品种进行分析。对照组为杜洛克猪、长白猪、大白猪、皮特兰猪4个西方商业猪种以及欧洲野猪和亚洲野猪，这些猪种的SNP数据均下载自网络共享平台（http://datadryad.org/）。整合芯片结果，共获得31 161个SNP位点。使用主成分分析对群体结构进行分析，可以将广东省地方猪种与西方猪种分为2类，其中，亚洲野猪与广东省地方猪种聚为一类，欧洲野猪与西方猪种聚为一类。

五、结语

SNP技术在肉产品溯源方面的研究具有很大的优势，然而在实际应用方面，要大范围推广存在诸多困难，比如动物个体和品种的鉴别，由于样本种群的地理和遗传背景差异，初次筛选的SNP位点在不同个体和群体间的适用性往往不高，通常需要不断优化样本筛选的方法、扩大样品数量来获得理想的SNP组合。然而随着研究的不断深入、相关领域数据库的逐步建立，SNP的研究应用将逐步走向成熟，以SNP标记为特征的肉产品溯源技术，将在今后的溯源应用和食品安全保障方面，发挥更为重要的作用。