采自甘南州的21株野生羊肚菌的分子学鉴定

杨琴 王三喜 王海峰 冶晓燕

摘要：甘南藏族自治州境内高寒阴湿温差大，土壤肥力高，适宜羊肚菌生长。经对采自甘南藏族自治州的野生羊肚菌进行组织分离，获得21份菌丝培养物，并对其采用ITS、ef1-α、rpb1以及rpb2片段联合矩阵序列分析鉴定。结果表明，21个供试菌株均属黑色羊肚菌支系，其中19株为三地羊肚菌（Morchella eohespera），2株为羊肚菌属Mel-13，且这2种羊肚菌目前已实现人工栽培。

关键词：甘南藏族自治州;羊肚菌;分子鉴定;序列联合分析

中图分类号：S646.7        文献标志码：A        文章编号：1001-1463（2021）05-0050-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.05.012

Molecular Identification of 21 Strains of Wild Morchella spp. from Gannan Tibetan Autonomous Prefecture

YANG Qin 1， WANG Sanxi 2， WANG Haifeng 2， YE Xiaoyan 3

（1. Institute of Vegetable， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;2. Agricultural Science Research Institute of Gannan Tibetan Autonomous Prefecture， Gannan Gansu 747000， China;3. College of Life Science， Northwest Normal University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：Gannan Tibetan Autonomous Prefecture has high cold damp， large temperature difference between day and night， and fertile soil， which is very suitable for the growth of Morchella spp. 21 mycelium cultures were obtained by tissue isolation from wild Morchella collected from Gannan Tibetan Autonomous Prefecture in this study， and were identified by ITS， ef1-α， rpb1 and rpb2 joint matrix sequence analysis. The results showed that all the 21 strains were Elata Clade， 19 of which were Morchella eohespera， and 2 strains were Morchella spp. Mel-13.， Moreover， these two kinds of Morchella have been cultivated artificially.

Key words：Gannan Tibetan Autonomous Prefecture;Morchella spp.;Molecular identification;Sequence joint analysis

羊肚菌（Morchella spp.）隸属子囊菌亚门（Ascomycota）盘菌纲（Pezizomycetes）盘菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae），是一类世界公认的珍稀食药同源性真菌，也是目前国际上最重要的贸易真菌之一[1 ]，其子实体、菌丝、液体培养物中含有多糖、酶、脂肪酸、氨基酸、维生素、抗生素、甾醇等多种有效成分，在抗菌、抗肿瘤、抗氧化、保肾护肝、提高免疫力等方面均有显著作用[2 ]，独含的脯氨酸类似物具特殊香味，已被广泛应用于调味品以及食品添加剂领域[3 ]。

羊肚菌是一类喜凉的大型真菌，主要分布在北温带和寒温带地区，目前已知的羊肚菌分为3大类群：黄色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade）以及变红羊肚菌支系（Rufobrunnea Clade）[4 ]，共有61种，中国就分布着其中的30种[5 ]。甘南藏族自治州地处青藏高原东北边缘地区，境内海拔1 173～4 920 m，年平均气温1～13 ℃，高寒阴湿温差大，土壤为黑土类，肥力高、土质疏松，得天独厚的环境极利于羊肚菌生长[6 ]。随着现代分子生物学的发展，利用特异性基因片段进行物种鉴定已是当下生物学研究中常用的手段之一，目前大多数研究利用ITS片段就能对试验对象做出鉴定，但有研究显示，利用ITS序列仅能识别出约羊肚菌属76%的系统发育学物种，而利用ITS+ef1-a+rpb1+rpb2 多基因联合分析，则能鉴定出该属内的所有物种[7 ]。我们对从甘南藏族自治州获得的野生羊肚菌菌丝培养物采用ITS、ef1-α、rpb1以及rpb2片段联合矩阵序列分析进行分子鉴定与系统发育学分析，旨在准确鉴定甘南州野生羊肚菌资源类型，为当地羊肚菌资源的科学利用提供依据。

1   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1    供试菌株    2019 — 2020年，在羊肚菌子实体发生季对甘南藏族自治州夏河县、卓尼县、迭部县的野生羊肚菌进行了采集，通过组织分离共得到21份可产生菌核的菌丝培养物，编号为GN-M1、GN-M2、GN- M3、GN-M4、GN-M5、GN-M6、GN-M7、GN-M8、GN-M9、GN-M10、GN-M11、GN- M12、GN-M13、GN-M14、GN-M15、GN- M16、GN-M17、GN-M18、GN-M19、GN- M20、GN-M21。

1.1.2    药品和试剂    PDA合成培养基、HP Fungal DNA Kit D3195-01试剂盒、琼脂糖、TAE等，均由北京奥科鼎盛生物公司提供。

1.2   试验方法

1.2.1    DNA提取    采用柱式HP Fungal DNA Kit D3195-01试剂盒提取供试菌株菌丝总DNA。

1.2.2    DNA扩增   本试验需要4对扩增引 物[8 ]，具体序列详见表1。扩增反应体系：采用25 μL体系，正反引物各1 μL，2× Taq Mix 酶12.5 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 补充至25 μL;扩增反应过程：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 变性10 s，复性15 s（ITS 50 ℃、ef1-α 58 ℃、rpb1 55 ℃、rpb2 54 ℃），72 ℃延伸20 s， 35个循环，最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

1.2.3   扩增产物的检测与测序   将1.2.2中引物ITS、ef1-α、rpb1、rpb2的扩增产物采用1%的琼脂糖电泳（100 mL 1×TAE+1g琼脂糖）进行检测，检测完好后送至北京奥科鼎盛生物公司测序。

1.2.4   测序结果对比及系统发育学分析   测序得到的序列在NCBI中进行BLAST，下载同源性大于99%的序列进行系统发育学分析;分别构建ITS、ef1-α、rpb1、rpb2矩阵，在BioEdit中进行调整，最后整合成联合矩阵，采用MEGA 7.0 软件Neighbor-joining 聚类分析方法构建系统发育树。

2   结果与分析

2.1   供试菌株的DNA扩增分析

供试菌株的4个特异性片段经PCR扩增后对其产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。21株供试菌株的4个特异性片段扩增很好，电泳条带清晰单一。

2.2   供试菌株的系统发育分析

对测序筛选同源性较高的序列进行ITS、ef1- α、rpb1、rpb2序列联合矩阵分析和系统发育树构建，结果见图2。由图2可知，供试菌株分属于2个类群，其中菌株GN-M1～GN-M18、GN-M21共19株，与Morchella eohespera（三地羊肚菌）亲缘关系近;GN-M19和GN-M20与Morchella sp. Mel-13亲缘关系近。支持率均为99%。

3   结论与讨论

采用ITS、ef1-α、rpb1、rpb2序列联合矩阵分析对分离得到的可产核的野生羊肚菌菌丝进行了鉴定，确定供试菌株均属于黑色羊肚菌支系，其中GN-M1、GN-M2、GN- M3、GN-M4、GN-M5、GN-M6、GN-M7、GN-M8、GN-M9、GN-M10、GN-M11、GN- M12、GN-M13、GN-M14、GN-M15、GN- M16、GN-M17、GN-M18、GN-M21為三地羊肚菌（Morchella eohespera）;GN-M19、GN- M20为羊肚菌属（Mel-13），这2个种目前已实现人工栽培[9 ]，为开发甘肃省高寒冷凉区本土化羊肚菌品种提供了可能。

此次羊肚菌资源调查所得物种仅有2个，可能是由采集时间和地点过于集中所致。后续研究应该按不同时段，并且分散调查地点采集标本，更全面的获得甘南藏族自治州的野生羊肚菌标本，以便更准确地分析该物种在甘南州的分布，为进一步开发利用当地野生菌资源提供依据。

参考文献：

[1] VOITK，ANDRUS，MICHAEL W. BEUG， et al. Two new species of true morels from Newfoundland and Labrador：cosmopolitan Morchella eohespera and parochial M. laurentiana[J].  Mycologia，2016，108（1）：31-37.

[2] 尚千涵，杨   婷，高其媛，等.  羊肚菌属物种分类、系统进化和药用价值研究进展[J]. 中草药，2021，52（7）：2154-2162.

[3] 袁明生，孙佩琼.  四川蕈菌[M]. 成都：四川科学技术出版社，1995.

[4] RICHARD，FRANCK，JEAN-MICHEL BELLANGER，et al. True morels（Morchella，Pezizales） of Europe and North America：Evolutionary relationships inferred from multilocus data and a unified taxonomy[J].  Mycologia，2014，107（2）：359-382.

[5] 杜习慧，赵   琪，杨祝良.  羊肚菌的多样性、演化历史及栽培研究进展[J].  菌物学报，2014，33（2）：183-197.

[6] 王海峰，王三喜，杨   琴. 甘南藏族自治州野生羊肚菌生长环境调查[J].  农业技术与装备，2021（1）： 37-38.

[7] DU XIHUI，ZHAO QI，YANG ZHULIANG，et al. Morchella ITS rDNA phylogenetics-How well do ITS rDNA sequences differentiatespecies of true morels（Morchella）[J].  Mycologia，2012，104（6）：1351-1368.

[8] 赵建俊，吉建成，于国民，等.  采自山东的几株野生羊肚菌鉴定[J].  中国食用菌，2020，

39（12）：28-32.

[9] 杜习慧.  黑色羊肚菌支系的物种资源、生殖模式和遗传多样性研究进展[J].  菌物研究，2019，17（4）：240-251.

（本文责编：陈    珩）