南繁区水稻病毒病发生情况及分子鉴定

谢海霞等

摘 要 对海南岛南部三亚、琼海、陵水等南繁水稻产区市县的病毒病发生情况进行调查，同时根据国内外已报道的10种主要水稻病毒设计特异PCR检测引物，对23个疑似水稻病毒样品进行分子检测，结果表明：海南南繁区水稻病毒病主要有2种，即由南方水稻黑条矮缩病毒（southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的南方水稻黑条矮缩病和由水稻齿叶矮缩病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）引起的水稻齿叶矮缩病；经分子检测鉴定了6例南方水稻黑条矮缩病样品和14例水稻齿叶矮缩病样品，检出2个交叉复合感染的样品，2种病样的检出率分别为 26.09%和60.87%，其余8种水稻病毒均未检测到。研究结果表明，南方水稻黑条矮缩病毒和水稻齿叶矮缩病毒是南繁水稻种植区域需重点防治的病害对象。

关键词 南繁 ；水稻 ；黑条矮缩病 ；齿叶矮缩病 ；分子鉴定

分类号 S435.111.1

Abstract Circumstance of rice virus disease in southern Hainan island rice-planting areas including Sanya， Qionghai and Lingshui was investigated. Specific primers for 10 known rice virus species were designed for PCR tests. A total of 23 suspected virus-infected samples were tested. Molecular identification results showed that there were two major rice virus species existed in Hainan winter-breeding areas： southern rice black-streaked dwarf virus （SRBSDV） and rice ragged stunt virus （RRSV）. 6 SRBSDV-infected samples and 14 RRSV-infected samples were identified by PCR and sequencing methods. 2 samples were co-infected by both SRBSDV and RRSV. Infection rates of SRBSDV and RRSV were 26.09% and 60.87%， separately. The other 8 viruses were not detected. This study showed that SRBSDV and RRSV are key diseases in Hainan winter-breeding areas and should be carefully prevented.

Keywords Hainan winter-breeding areas ； rice ； SRBSDV ； RRSV ； molecular identification

中国已发现的水稻RNA病毒约有10种[1]，包括水稻黑条矮缩病毒（rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）、南方水稻黑条矮缩病毒（southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）、水稻瘤矮病毒（rice gall dwarf virus，RGDV）、水稻齿叶矮缩病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）、水稻矮缩病毒（rice dwarf virus，RDV）、水稻条纹病毒（rice stripe virus，RSV）、水稻草矮病毒（rice grassy stunt virus，RGSV）、水稻东格鲁球状病毒（rice tungro spherical virus，RTSV）、水稻黄矮病毒（rice yellow stunt virus，RYSV）和水稻黄斑驳病毒（rice yellow mottle virus，RYMV）。由水稻病毒引起的水稻病毒病已成为影响水稻生产的主要病害。20世纪50年代水稻黑条矮缩病首次在中国被报道，90年代后在中国南方水稻产区流行，近年来呈逐年加重的趋势，造成严重的经济损失[2-4]。其中，南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）是在广东、海南等地新发现的一种水稻病毒，主要由白背飞虱（Sogatellafurcifera）以持久性方式传播[5-6]。此外，水稻齿叶矮缩病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）是危害水稻生产的一种世界性病害，在中国、日本、菲律宾和东南亚地区都有报道。

南繁是指每年9月至次年5月在海南省南部的三亚、乐东、陵水等地从事农作物品种选育、种子生产和种质鉴定等。据不完全统计，全国有30个省（市、自治区）的550多家单位近5 000名科技人员云集于海南南繁区域开展育种工作。南繁育种区域聚集了丰富的水稻种质资源，为水稻品种选育提供了优良的育种材料，已成为中国水稻育制种的“绿色基因库”[7]。然而，由于南繁区水稻育种材料的汇聚和扩散，南繁区域也极易于成为水稻病毒病害传播和扩散的源头，对南繁水稻种业的健康发展构成了潜在的威胁。但目前尚未见关于南繁区水稻病毒病害的报道。鉴于此，本研究调查和鉴定了海南省三亚、陵水、琼海等水稻种植区域的病毒为害情况，为防治和控制南繁区水稻病毒的为害和传播提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2014年1月，在海南岛南繁区域（包括三亚、陵水、琼海等县市水稻产区）共采集23份水稻疑似病毒病害样品（表1），每份样品采集水稻叶片3～5片，编号和记录后置于冰袋中保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据文献报道获得水稻病毒PCR检测引物信息（表2），或通过GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查询获得水稻病毒的mRNA序列信息，利用Primer3软件（http：//primer3.ut.ee/），采用默认参数设计获得PCR检测引物序列（表2）。

1.2.2 总RNA提取及反转录

采用Plant RNA Extraction kit试剂盒（TianGen Biotech）提取水稻叶片总RNA，以1.5%琼脂糖凝胶电泳检验总RNA的完整性，用RNA反转录试剂盒（Fermantas）将总RNA反转录得到cDNA，用作PCR反应的模板。

1.2.3 PCR检测

分别用表2中的引物对反转录所得到的cDNA进行PCR扩增。反应体系如下：模板cDNA 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，Ex-Taq 0.25 μL，10× Buffer 2 μL，10 mmol/L 正反引物各0.5 μL，加ddH2O至总体积为20 μL。PCR扩增条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 s， 50℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR结束后，取8 μL产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 克隆转化

采用DNA回收试剂盒（Sangon）回收PCR产物，将其连接到pMD18-T载体上，12 h后将连接产物转化大肠杆菌DH5α；12～16 h后，挑取平板上的单菌落接种于含有0.1%氨苄的LB培养液中震荡培养8 h，然后使用克隆载体通用引物M13-47和RV-M进行菌液PCR；反应结束后取8 μL扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定；挑取阳性克隆送上海Sangon公司测序。

1.2.5 序列测定和同源性比较

将测序结果去除低质量序列和污染序列后，登录GenBank进行BLASTn比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.

cgi），通过序列相似性比较，判断来源病毒物种名称。

2 结果与分析

2.1 水稻总RNA的提取

经提取获得23个水稻叶片样品的总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示，RNA主要集中于100、750、1 500 bp 三个条带长度，RNA质量较好（OD260/OD280≈2.0），符合RT-PCR试验的要求（图1）。

2.2 RT-PCR检测

获得样品总RNA后，经反转录获得cDNA，利用所获得的PCR引物（表2）对23个疑似病毒样品依次进行RT-PCR检测。结果显示，除SRBSDV和RRSV检测呈阳性以外，其它病毒引物检测都为阴性（图2，3）。

应用南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）引物检测样品时，其中NFR3、NFR7、NFR8、NFR9、NFR16、NFR19共6例样品的检测显示为阳性，在600 bp目标区域有明显的PCR产物条带（图2）。23例疑似病害样品中，南方水稻黑条矮缩病毒检出率为26.09%。而应用水稻齿叶矮缩病毒（RRSV）引物检测样品时，其中NFR2、NFR3、NFR4、NFR5、NFR9、NFR10、NFR12、NFR13、NFR14、 NFR15、NFR20、NFR21 、NFR22、NFR23共14例样品的检测显示为阳性，在700 bp目标区域有明显的PCR产物条带（图3）。23例疑似病害样品中，水稻齿叶矮缩病毒检出率达60.87%。检测结果显示，NFR3和NFR9 2例样品在SRBSDV和RRSV引物检测中均呈阳性，可能同时交叉感染这2种病毒（图2，3）。

2.3 病毒序列鉴定

通过对PCR检测为阳性的产物进行回收、克隆转化和测序鉴定，获得了PCR扩增产物的核苷酸序列信息，并将其与GenBank数据库进行BLASTn比对（表3）。鉴定结果显示，14例样品为水稻齿叶矮缩病毒感染，6例样品为南方水稻黑条矮缩病毒感染，其中NFR3和NFR9 2例样品同时感染了上述2种病毒。结果表明，危害南繁区域水稻的水稻齿叶矮缩病毒为同一种（序列号：GQ329711.1），与此同时，可能存在多个危害南繁区域水稻的南方水稻黑条矮缩病毒变种。

3 讨论

本研究基于已知的10种水稻RNA病毒设计了RT-PCR引物，对从南繁区采集的23个疑似病害样品进行检测，获得南方水稻黑条矮缩病毒感染样品6例、水稻齿叶矮缩病毒感染样品14例，其中有2例是复合感染的样品，没有检测到其余8种水稻病毒侵染的样品。已知的10种水稻RNA病毒基因组均属于双链RNA（dsRNA）类型，在病毒感染的不同时期寄主体内的病毒dsRNA含量发生变化，因此在提取疑似病样的总RNA时，难以获得一些病毒dsRNA含量较低的RNA样品，导致PCR检测呈阴性。此外，除已报道的10种水稻RNA病毒以外，可能存在未知的病毒种类，由于缺少基因组信息，因此还无法通过PCR检测到。

本研究结果显示，南方水稻黑条矮缩病毒和水稻齿叶矮缩病毒是中国南繁区域危害水稻的2种主要病毒。近年来，南方水稻黑条矮缩病毒已成为危害中国水稻生产的重要病毒，主要在以种植籼稻为主的长江以南地区为害水稻，在南方的13个省份均有报道，造成了严重的损失[15]。水稻黑条矮缩病毒主要在长江流域水稻种植区域发生为害，尤其在江苏地区，水稻黑条矮缩病毒几乎遍布全省[3]。据报道，这2种病毒可侵染常规粳稻、常规籼稻、杂交粳稻、杂交籼稻、常规糯稻等，生产中尚未见对这2种病毒高抗的水稻类型或品种[11，15-16]。据报道，由于水稻齿叶矮缩病毒病害发病率普遍较低，未广泛流行，导致该病未得到重视。但是，该病近年在中国南方局部地区已造成比较严重的损失，有流行爆发的可能[16]。

鉴于中国海南南繁区域水稻育种材料来源广泛且易于扩散的特殊性，亟待加强对水稻病毒的检测和检疫。本研究结果发现，南方水稻黑条矮缩病毒和水稻齿叶矮缩病毒是南繁区域目前需要重点防控的病害对象，南繁区域发现的南方水稻黑条矮缩病毒的多样性较高，可能存在多个变种。鉴于病毒极易产生变异而导致防治困难的特点，建议南繁区域科研单位重点加强对上述2种病毒的检疫和检测，预防水稻病毒病的大规模为害。在本研究基础上，笔者分别研发了用于快速检测和鉴定南方水稻黑条矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒的分子检测试剂盒（待发表），为南繁区域水稻病毒的检测和防疫提供技术支持。

参考文献

[1] 李明福. 中国水稻种子出口中的病毒风险评述[J]. 植物检疫， 2005， 19（4）： 225-226.

[2] 陈声祥， 张巧艳. 我国水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病研究进展[J]. 植物保护学报，2005，32（1）：97-103.

[3] 季英华，任春梅，程兆榜，等. 江苏省近年来新发生的一种水稻矮缩病害病原初步鉴定[J]. 江苏农业学报，2009，25（6）：1 263-1 267.

[4] 徐 蕾，吴佳文，郭 竹， 等. 扬州市邗江区水稻黑条矮缩病发生规律及防治对策[J]. 江苏农业科学， 2011（1）：156-158.

[5] Zhang H M， Yang J， Chen J P， et al. A black-streaked dwarf disease on rice in China is caused by a novel fijivirus[J]. Arch Viro， 2008， 153（10）： 1 893-1 898.

[6] Zhou G， Wen J， Cai D， et al. Southern rice black-streaked dwarf virus： A new proposed Fijivirus species in the family Reoviridae[J]. Chinese Science Bulletin， 2008， 53： 3 677-3 685.

[7] 陈冠铭，林亚琼，李劲松. 国家南繁育制种价值分析与发展对策思考[J]. 中国种业，2012（3）：1-3.

[8] 章松柏， 李大勇， 肖冬来， 等. 水稻黑条矮缩病的发生和病毒检测[J]. 湖北农业科学，2010，49（3）：592-594.

[9]范国成，吴祖建，林奇英，等. 水稻瘤矮病毒基因组S8片段全序列测定及其结构分析[J]. 农业生物技术学报，2005，13（5）：679-683.

[10] 赵 芹，沈文锦，张翼翔，等. 水稻瘤矮病毒S11基因沉默抑制子的原核表达及抗血清制备[J]. 植物病理学报，2010，40（6）：574-578.

[11] 刘红艳，章友爱，廖咏梅，等. 广西南方水稻黑条矮缩病毒及水稻齿叶矮缩病毒的分子检测[J]. 南方农业学报，2012，43（7）：955-960.

[12] 丁新伦，谢荔岩，潘 贤，等. 水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白的原核表达、抗血清制备及初步应用[J]. 激光生物学报，2012，21（6）：546-550.

[13] 彭潞波，魏春红，方 琦，等. 云南3个不同地区水稻矮缩病毒S8片段的序列分析[J]. 云南大学学报：自然科学版，2008，30（S1）：21-24..

[14] 程兆榜，任春梅，周益军，等. 灰飞虱来源的水稻条纹病毒外壳蛋白基因遗传多样性[J]. 植物病理学报，2012，42（6）：585-593.

[15] 周国辉，张曙光，邹寿发，等. 水稻新病害南方水稻黑条矮缩病发生特点及危害趋势分析[J]. 植物保护， 2010，36（2）：144-146.

[16] 郑璐平，谢荔岩，连玲丽，等. 水稻齿叶矮缩病毒的研究进展[J]. 中国农业科技导报，2008，10（5）：8-12.