烟草工业废水和烟草浓缩液中甾体雌激素的生物降解研究

孙福艳，叶建斌，马歌丽，齐晓娜，张展，冯颖杰，杨峰

1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；

2.河南中烟工业有限责任公司，河南 郑州 450002；

3.河南卷烟工业烟草薄片有限责任公司，河南 许昌 461000

0 引言

甾体雌激素是一类具有环戊烷多氢菲母核结构的类固醇激素.环境中的甾体雌激素分为两大类：一类是人工合成甾体雌激素(外源雌激素)，如乙炔基雌醇(Ethinyl Estradiol,EE2)；另一类是天然甾体雌激素(内源雌激素)，如雌酮(Estrone，E1)、雌二醇(Estradiol,E2)、雌三醇(Estriol，E3)等[1].甾体雌激素可通过多种途径进入城市污水，多数废水处理厂中可检测出质量浓度高达数百ng/L的雌激素[2].甾体雌激素属于持久性有机污染物，在环境中十分稳定且难以分解，随着食物链的富集作用，其质量浓度逐渐上升，从而对生物界造成难以预估的危害.相关研究表明：环境中含有纳克级质量浓度的甾体雌激素即能表现出较强的生态(生理)毒性[3]，对人、水生生物、家禽动物等具有极大危害(包括生殖毒性[4-5]、发育毒性[6-7]和致癌性风险[8-9])，世界卫生组织将甾体雌激素归为1类致癌物[1].一些学者认为，环境中的甾体雌激素若不进行降解或去除，将会威胁人类的生存和发展[10].

生物降解甾体雌激素是随着微生物自身代谢过程进行的，成本低、占地小、不需要特殊设备，可彻底去除甾体雌激素或将其转化为无毒无害的物质(CO2、H2O等)，被称为环境友好型污染治理技术[11].目前，微生物降解是去除环境中甾体雌激素污染相对有效的途径，而降解甾体雌激素的微生物大部分可从废水处理厂的活性污泥、堆肥或受甾体雌激素污染的土壤中筛选分离得到.L.Y.Jiang等[12]从活性污泥中分离得到的5株菌株皆具有高效降解E2的能力，能使E2转化为E1，可大大降低E2生物降解过程中废水中总雌激素的活性.F.Kurisu等[13]从土壤样品中分离出5株能利用17β-雌二醇(17β-E2)和E1的细菌菌株，均显示出较高的E1和E2降解活性.Q.Qiu等[14]从北京一家制药厂附近收集的土壤样品中分离出1株不动杆菌DSSKY-A-001，利用该菌株降解甾体雌激素时发现，3 d时甾体雌激素降解率为76%，6 d时甾体雌激素降解率达90%.

甾体雌激素的降解菌绝大部分为细菌，少部分为真菌、藻类植物[1].假单胞菌SJTE-3能够利用不同的甾体雌激素(17β-E2、E1、E3和17α-乙炔基雌二醇)并将其转化为非甾体化学物质[15].马红球菌Y50156在24 h内，对质量浓度为100 mg/L的甾体雌激素(E1、E2、E3、EE2)降解率均大于95%[16].将不动杆菌属(LM1)和假单胞菌属(LY1)的细菌菌株共同培养，可在7 d内快速去除约98%的E2(5 mg/L);单独培养时，菌株LM1和LY1在 7 d 内可分别降解77%和68%的E2[17].

在烟草制品生产过程中产生的大量工业废水，因烟叶中的尼古丁、有机酸、氨基联苯、萘胺等有毒有害物质而具有颜色深、成分复杂、毒性大、污染严重等特点，被欧盟法规认定为“有毒危险性废物”[18-19].烟草工业废水的水质波动大，一般降解甾体雌激素的微生物很难在该环境中生存，难以进行生物降解[19].目前尚无对烟草工业废水中甾体雌激素进行含量检测、生物降解等的研究报道.鉴于此，本文拟采用气相色谱(GC)法检测烟草工业废水和烟草浓缩液中甾体雌激素的质量浓度，并采用合适的生物方法从烟草工业废水处理厂的污泥中筛选出甾体雌激素降解菌，以实现微生物降解烟草工业废水和烟草浓缩液中甾体雌激素的目的，为烟厂工业废水的处理、排放及环境保护提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 样品

烟草工业废水(取样口为进水口，即未经处理的废水)、污泥(烟草工业废水处理厂未经处理的污泥，含水率80%左右)、烟草浓缩液(将烟梗、烟末、烟草废弃物等烟草原料放入粉碎机中将其打碎，取烟草碎料与水以112的质量比混合，使烟草碎料充分浸泡于水中并搅拌，浸提液浓缩至波美度为26，即得)，河南卷烟工业烟草薄片有限责任公司提供.

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：K2HPO4、MgSO4·7H2O、Na2HPO4、CaCl2、NaNO3、FeSO4·7H2O、(NH4)2SO4、NaCl，天津市大茂化学试剂厂产；KI，成都市科龙化工试剂厂产；ZnSO4·7H2O、H3BO3，天津市凯通化学试剂有限公司产；乙酸乙酯、二甲基亚砜(DMSO)，天津市富宇精细化工有限公司产；乙酸苯乙酯(>99%)，阿达玛斯试剂有限公司产.以上试剂均为分析纯.E1(98%)，上海麦克林生化科技有限公司产；琼脂粉、酵母提取物、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限公司产；改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒，生工生物工程(上海)有限公司产.

主要仪器：BSA2202S电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司产；DGG-9140电热恒温鼓风干燥箱、SHP-150生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司产；LEICA ICC50电子显微镜，徕卡仪器有限公司产；SW-CJ-ID超净工作台，苏州净化有限公司产；GR85DA高压蒸汽灭菌锅，致微仪器有限公司产；ZQWY-200S摇床，上海知楚仪器有限公司产；EYELASB-1100旋转蒸发仪，瑞徽电子(上海)有限公司产；SB25-120超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司产；GC-7820A气相色谱连用仪，美国安捷伦科技公司产；UV-2300紫外-可见分光光度计，北京普析通用有限责任公司产.

1.3 培养基

分离培养基：K2HPO41 g、Na2HPO41.5 g、NaNO31 g、MgSO4·7H2O 6.5 g、CaCl20.01 g、FeSO40.01 g、DMSO 100 μL、E1 1.0 g、琼脂 20 g、去离子水1 L,pH值调至7.0～7.2，121 ℃条件下高压灭菌 20 min.

种子(LB)培养基：蛋白胨10 g、酵母粉 5 g、NaCl 10 g、去离子水1 L，pH值调至7.2， 121 ℃ 条件下高压灭菌20 min.

发酵培养基：(NH4)2SO40.777 g、K2SO40.170 8 g、KH2PO40.530 8 g、Na2HPO42.184 7 g、MgSO4·7H2O 0.036 97 g、CaSO4·H2O 0.010 204 g、KI 0.000 166 g、ZnSO4·7H2O 0.000 575 g、MnSO4·7H2O 0.000 338 g、FeSO4·7H2O 0.022 24 g、H3BO30.000 124 g、E1 0.45 g、DMSO 100 μL、去离子水1 L，pH值调至7.0～7.2，121 ℃条件下高压灭菌20 min.

PBS缓冲液： KH2PO40.24 g、Na2HPO41.44 g、NaCl 8 g、KCl 0.2 g，pH值调至7.4，最后定容至1 L，115 ℃条件下高压灭菌20 min.

1.4 实验方法

1.4.1 甾体雌激素降解菌的分离、筛选和鉴定富集：取10 g污泥加入100 mL分离培养基中，于200 r/min,37 ℃条件下振荡培养5～7 d后转接到新鲜分离培养基中，重复5～7次，进行选择性富集培养.

初筛：挑取分离平板中的单菌落移至LB培养基中，于200 r/min、37 ℃条件下振荡培养14～16 h，取1 mL菌液进行稀释，稀释与上述分离步骤一致.将稀释液均匀涂布于LB平板和唯一碳源(E1)平板上，从唯一碳源(E1)平板挑取单菌落至LB新鲜培养基中，如此反复操作3～5次，筛选出在唯一碳源(E1)平板上长势较好且在LB平板上为单菌落的菌株.

复筛：从初筛唯一碳源(E1)平板上挑取单菌落，活化后接种于发酵培养基中，于200 r/min、37 ℃条件下振荡培养5～7 d，取100 μL 菌液稀释，均匀涂布于富集培养平板上，挑选出长势优良、菌落均匀的单菌株.

形态学鉴定：经富集、分离、初筛、复筛后获得1株降解甾体雌激素E1的菌株，对其进行形态学鉴定.

分子生物学鉴定：提取细菌基因组DNA，对基因组进行PCR扩增(上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物1492R：5′-TACCTTGTTACGATT-3′)，扩增产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，从BLAST结果中挑选18株与该微生物同源性较为相近的细菌基因序列，通过Clustal X进行多重序列比对，并用MEGA 5.0软件构建系统发育树.

1.4.2 优势菌种特性研究从唯一碳源(E1)平板上挑取单菌落移至LB培养基中，于37 ℃、200 r/min条件下振荡培养12～16 h，根据菌株生长情况，在不同时间测定OD600.以培养时间为横坐标，OD600为纵坐标，绘制标准曲线.设置3组平行实验.

1.4.3 菌株生长培养及E1降解动力学实验活化菌株：从唯一碳源(E1)平板上挑取单菌落,移至100 mL LB培养基中,活化菌株14 h，于4000 r/min、4 ℃条件下，离心培养菌液 10 min，弃上清液，利用缓冲液洗涤沉淀，重复操作3次后，添加缓冲液得10 mL菌悬液.

降解动力学实验：取1 mL菌悬液于 100 mL 发酵培养基中，于37 ℃、200 r/min条件下进行好氧发酵，分别在0 d、3 d、5 d、7 d、9 d 时取样.取1 mL进行蛋白质量浓度测定(A595)，剩余发酵液经萃取、浓缩后进行GC分析.取1 mL无菌水加入 100 mL 发酵培养基中作为对照，考查挥发、器壁吸附等非生物因素对减少甾体雌激素质量浓度的贡献.设置3组平行实验.按照公式DE1=(Ct-C0)/Ct来计算E1降解率，其中：DE1为E1降解率，Ct为对照组E1质量浓度，C0为实验组E1质量浓度.

GC条件：HP-5 (30 m×320 μm×0.25 μm)色谱柱；载气为He；载气流速为1 mL/min；采用不分流方式进样；进样量为1 μL；升温程序为初始温度50 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升温至260 ℃，保持5 min，再以2 ℃/min升温至270 ℃，保持10 min.

微生物生长测定：利用改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒检测降解实验中微生物的生长情况.设置牛血清白蛋白(BSA)质量浓度分别为50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL，利用分光光度计测定各质量浓度下的A595，其中以蒸馏水作为空白对照.

1.4.4 烟草工业废水和烟草浓缩液中甾体雌激素的降解实验分别取100 mL烟草浓缩液、烟草工业废水，加入等体积的乙酸乙酯反复萃取3次，加入无水NaSO4干燥4 h以上，然后置于旋转蒸发仪中，于50 ℃、30 r/min、0.1 MPa条件下真空浓缩至1 mL，加入内标乙酸苯乙酯，与浓缩液以19的体积比混合均匀后，用0.22 μm有机膜过滤，滤液进行GC定量分析，GC条件同1.4.3.

菌株活化后，取1 mL菌悬液分别置于100 mL烟草浓缩液和烟草工业废水中，于37 ℃、200 r/min条件下进行好氧发酵，9 d时结束发酵，经萃取、浓缩至1 mL后进行GC定量分析.

2 结果与讨论

2.1 甾体雌激素降解菌筛选及其鉴定结果分析

通过多次筛选，从污泥中筛选到一株可以利用E1作为唯一碳源的菌株(命名为ye22)，该菌株在平板上长势好、生长周期短、对于降解E1有一定的优势，菌株显微镜检测结果如图1所示.从图1可知，ye22菌株为革兰氏阴性短杆菌，单个排列，菌体饱满、光滑.

图1 菌株显微镜检测结果

将该菌株16S rRNA测序序列与GeneBank上已有的序列进行BLAST同源检索，发现该序列与琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)的序列同源性达到98%以上，初步判断该菌的分类地位为琼氏不动杆菌.为进一步探究该菌株与己知菌株亲缘关系及分类地位，构建ye22菌株进化树，如图2所示.由图2可知，该菌株应归属于琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii).

图2 ye22菌株进化树

2.2 ye22菌株生长特性研究结果分析

图3为ye22菌株的生长曲线，呈“S”形曲线.由图3可知，该菌株经10 h左右活化期后进入对数生长期，对数生长期维持时间为10～16 h，在17 h左右进入生长平稳期，最终OD600达到20左右.根据微生物生长的基本原理，在对数生长期的细胞活性较高.为更好地在发酵中发挥细胞活力，选择培养14 h的菌液为后续发酵种子液，该时期菌株生长曲线的斜率最高，即该时期其活力最高.

图3 ye22的生长曲线

2.3 E1降解动力学实验结果分析

E1降解动力学实验结果如图4所示.因E1在发酵液中存在微弱不溶解的现象，对OD600检测结果具有一定的干扰性，故通过在发酵过程中测定蛋白(BSA)质量浓度的变化表征发酵过程中微生物随底物的变化情况[20].由图4a)可知，在0～350 μg/mL范围内， BSA质量浓度与A595呈线性关系，说明该标准曲线可用于后续发酵过程中菌株含量的检测.

由图4b)可知，ye22菌株在第 3 d时生物量大幅上升，E1质量浓度有一定程度的降低，计算得E1降解率为23.34%，在第9 d时计算得E1降解率为41.88%，说明E1可以作为碳源供微生物生长，因此ye22菌株在该时期降解E1属于一种细胞生长代谢过程.在发酵3～7 d过程中，ye22菌株的生物量保持恒定，细胞生长可能处于稳定期，该时期ye22菌株对E1的降解可能主要归因于微生物降解E1为其他物质，而不是合成自身细胞结构.

图4 E1降解动力学实验结果

据报道[21]，污泥中仅有1%～2%的细菌被认为是可利用E1的细菌，这是因为在甾体雌激素的降解过程中，一般可以先将E2降解成E1，但进一步降解E1为其他物质则比较困难[22].J.X.Ke等[23]以甾体雌激素为唯一碳源，发现不动杆菌降解时间长，15 d才能将E2彻底降解,且不能降解E1.而本研究结果显示，ye22菌株不但能利用E1为唯一碳源合成自身细胞骨架，维持细胞生长，还可以在细胞生长进入稳定期后将E1进一步降解成其他产物，但在GC检测中并未发现新物质的生成，推测可能降解生成了CO2和H2O，这对于微生物将甾体雌激素进一步降解成无毒无害的物质具有重要意义.

2.4 烟草工业废水和烟草浓缩液中E1的降解实验结果

烟草工业废水和烟草浓缩液中E1的降解结果如图5所示.由图5a)可知，烟草工业废水和烟草浓缩液中均检测到较高质量浓度的E1，分别为1.41×10-4g/L和9.01×10-5g/L.与其他水体环境相比，烟草工业污水和烟草浓缩液中的E1质量浓度较高，这可能与烟草中的甾醇类化合物有关[24]；另外，工业废水中E1的质量浓度是浓缩液的近2倍，这说明烟草工业废水中甾体雌激素类物质经加工得到了一定富集，在排放前需要进行合适的处理.在之前的研究中，未见在烟草工业废水和烟草浓缩液中检测到甾体雌激素类污染物的报道，本研究的检测结果补充了这方面的数据.

由图5b)可知，通过ye22菌株发酵，烟草工业废水和烟草浓缩液中E1均有不同程度的降解，9 d后，其E1降解率分别为32.07 %和27.23 %，烟草浓缩液中E1的降解率较小，这可能是因为烟草浓缩液中烟碱等其他有毒物质含量较高，对微生物具有一定抑制作用[25].

图5 烟草工业废水和烟草浓缩液中E1的降解结果

3 结论

本文从烟草工业废水处理厂的污泥中筛选出一株能以E1为底物的甾体雌激素降解菌株ye22，并对该菌株进行16S rRNA鉴定、降解动力学及应用研究.结果表明，该菌株为琼氏不动杆菌，该菌株发酵3～9 d时，E1的质量浓度逐渐降低，发酵9 d时，对E1的降解率达41.88%；通过GC定量分析发现，烟草工业废水和烟草浓缩液中E1质量浓度较高，分别达到1.41×10-4g/L和9.01×10-5g/L;收集培养到对数期的该菌株，接种于烟草工业废水和烟草浓缩液中，发酵9 d，E1降解率分别为32.07%和27.23 %.为更全面了解该菌株的功能特性，下一步将开展ye22菌株全基因组检测及基因编码降解酶的研究，并寻找一种有效的投菌方法以提高烟草工业废水和烟草浓缩液中甾体雌激素降解率.