嗜麦芽窄食单胞菌的培养基优化及其在烟叶发酵中的初步应用研究

黄申，周利峰，吕乔，孙海峰，景天，李石头，闫茗熠，毛多斌

1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州450001；

2.深圳烟草工业有限责任公司，广东 深圳 518109；

3.浙江中烟工业有限责任公司 技术中心，浙江 杭州 310024

0 引言

西柏烯类化合物(Cembratrienes)是烟草中重要的大环二萜类物质.西柏烯类化合物在自然界中主要存在于新鲜烟叶、烟花的表面腺毛分泌物和海洋珊瑚生物中[1-4].烟叶表面腺毛分泌物随新鲜烟叶成熟度的增加而增多，当烟叶完全成熟时其质量分数达到最大值，而作为其主要成分的西柏烯类化合物也会逐步累积并达到质量分数最大值.其中，新鲜烟叶中的西柏三烯-4,6-二醇质量分数可达0.7%，同时具有α-CBD和β-CBD两种差向异构体[5-7].西柏三烯-4,6-二醇是一种重要的致香前体物，在一系列加工处理过程中，其发生氧化降解，生成多种重要的烟气香气物质，而这些香气物质主要成分是茄酮及其衍生物，能与烟草本香相协调，是卷烟香气成分的重要贡献者[8-11].另外，西柏三烯-4,6-二醇对卷烟品质也有一定影响，据报道，将西柏三烯-4,6-二醇加入卷烟中，可使吃味更丰满，提高卷烟的吸食品质[12].

然而，国内外关于西柏烯类化合物生物降解的研究较少，仅有利用雷公藤植物、美花烟草植物细胞催化降解西柏三烯-4,6-二醇，使其11位、12位双键被环氧化，10位、12位和13位双键被羟基化，并无西柏烯开环类化合物生成[13-17].黄申等[18-20]从初烤后烟叶中筛选到一株新鞘氨醇杆菌，该菌可降解西柏三烯-4,6-二醇生成金合欢醛，但催化效率偏低.

近年来，利用微生物发酵提升烟叶的可用性及品质已逐渐成为烟草行业的研究热点.笔者前期从烟叶中筛选到一株嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonassp.H3-1)，能以西柏三烯-4,6-二醇为唯一碳源生长，并检测到中间代谢物金合欢醛[21].本研究拟以该嗜麦芽窄食单胞菌为实验菌株，通过单因素试验优化其培养基，在此基础上，将该菌株制备成菌制剂后初步应用于烟叶发酵，并对比研究发酵前后烟叶的品质，以期为嗜麦芽窄食单胞菌在发酵烟叶中的应用提供新思路.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

材料：嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonassp.H3-1)，保存于郑州轻工业大学烟草行业生物技术重点实验室；云烟87 B2F，产自云南玉溪.

主要试剂：西柏三烯-4,6-二醇标样(纯度99 %)，郑州轻工业大学实验室自制[22-23]；K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、NaNO3、KNO3、FeSO4·7H2O、NaCl、KH2PO4、MnSO4、(NH4)2SO4、CaCl2·2H2O、Na2MoO4·2H2O、葡萄糖、蔗糖、乳糖、β-环糊精、麦芽糖、果糖、胰蛋白胨、尿素、酵母粉，上海麦克林生化科技有限公司产.以上试剂均为分析纯.

主要仪器：Agilent 6890a/5975c 型GC-MS联用仪，美国Agilent公司产；J6-MI型冷冻离心机，美国Beckman公司产；2600 UC/VIS型紫外可见分光光度计，美国Unic公司产；KBF240型恒温恒湿箱，德国 Binder公司产.

1.2 实验方法

1.2.1 主要培养基的配制种子培养基(1 L)：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，蒸馏水 1 L，pH值为7.

初始发酵培养基(1 L)：K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.005 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.65 g，MnSO40.001 g，(NH4)2SO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.1g，Na2MoO4·2H2O 0.005 g，pH值为7，高温灭菌20 min后加入西柏三烯-4,6-二醇水溶液，配制西柏三烯-4,6-二醇质量浓度为0.3 g/L的初始发酵培养基.

1.2.2 菌株生长曲线和西柏三烯-4,6-二醇降解曲线的绘制将嗜麦芽窄食单胞菌接种到种子培养基中，于30 ℃、150 r/min条件下活化培养24 h.在无菌条件下，配制14份等量的发酵培养基，每瓶按发酵培养基体积的1%接种种子菌液，以不接种种子菌液的发酵培养基作为对照，于30 ℃、150 r/min条件下进行培养.在培养6 h后，每隔6 h取样1次，72 h后停止取样.用移液枪取4 mL发酵菌液，采用紫外可见分光光度计检测其OD600，以反映菌体生长量；然后立即将剩余的菌液于4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，用二氯甲烷溶剂萃取西柏三烯-4,6-二醇，采用GC-MS检测其质量分数，并计算其降解率[18].以培养时间为横坐标，西柏三烯-4,6-二醇的降解率和发酵菌液OD600为纵坐标，利用Oringe软件绘制菌株生长曲线和降解曲线.

1.2.3 单因素试验1)碳源的选择.选择葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、β-环糊精6种碳源，以不添加碳源的发酵培养基为空白对照.分别在1 L发酵培养基中加入0.5 g碳源，分装后灭菌，在超净工作台中，按发酵培养基体积的1%接种种子菌液，于30 ℃、150 r/min条件下培养24 h.然后经离心、溶剂萃取、GC-MS检测确定西柏三烯-4,6-二醇的质量分数，计算其降解率，从而选择最佳碳源.改变最佳碳源在发酵培养基中的质量浓度(0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L、6.0 g/L、8.0 g/L 、16.0 g/L)，根据其对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响情况，确定最佳质量浓度.

2)氮源的选择.在最佳碳源的基础上，选择硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾、酵母粉、蛋白胨、尿素6种氮源，最佳氮源的选择方法同1).改变最佳氮源在发酵培养基中的质量浓度(0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L、6.0 g/L、8.0 g/L、16.0 g/L)，根据其对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响情况，确定最佳质量浓度.

3)初始pH值的选择.pH值对蛋白酶的活性具有一定的影响，因此发酵培养基初始pH值对菌株的生长及西柏三烯-4,6-二醇的降解率均有一定的影响.在最佳碳源、氮源的基础上，调节发酵培养基的初始pH值(5、6、7、8、9、10)，根据其对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响情况，确定最佳培养pH值.

4)培养温度的选择.温度对蛋白酶的活性具有一定的影响，因此发酵培养基的培养温度对菌株的生长及西柏三烯-4,6-二醇的降解率均有一定的影响.在最佳pH值的基础上，将发酵液分别置于不同温度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃)的摇床中进行培养，根据其对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响情况，确定最佳培养温度.

1.2.4 菌制剂的制备于10 000 r/min条件下，将培养24 h的菌液离心20 min得到菌体，再将其溶于无菌的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，得到OD600为2.0的细胞悬液，即为菌制剂.

1.2.5 烟叶发酵实验1)将菌制剂于35 ℃、pH值为7、150 r/min条件下振荡培养48 h，得到嗜麦芽窄食单胞菌活化液，待用.

2)将嗜麦芽窄食单胞菌活化液按5.00%、2.50%、1.25%和1.00%的添加量均匀喷洒到回潮后的烟叶样品(水分含量为15%)上，然后置于恒温恒湿箱(温度28 ℃，湿度80%)中进行发酵转化，每2 d取样一次.

3)取6 g烟叶样品剪碎置于250 mL三角瓶中，加入150 mL二氯甲烷，于20 ℃、100 W条件下超声萃取30 min，用100 mL质量分数为5%的磷酸酸洗3次，再用100 mL饱和食盐水水洗，直至pH值为7.经减压浓缩，以2,6-二氯甲苯作为内标，利用GC-MS联用仪检测烟叶样品中的挥发性香味物质的质量分数.GC-MS的检测条件如下.

GC条件：色谱柱为HP-5 MS(30 m×0.25 mm ×0.25 μm)；进样口温度280 ℃；高纯He作载气，流速为1 mL/min；升温程序设置为初始温度50 ℃，停留4 min，然后以2 ℃/min的速率升温至240 ℃时结束；不分流进样，进样量为1 μL；采用全扫描模式.

MS条件：传输线温度为280 ℃；离子源温度为280 ℃，四极杆温度为150 ℃；电离方式为电子轰击(EI)，电子能量为70 eV；溶剂延迟时间为8 min；扫描质量范围(m/z)为35～550 amu.

1.2.6 感官质量评吸将菌制剂发酵前后的烟叶样品制丝并添加到待评吸的卷烟中，由河南中烟技术中心组建11人评吸小组，采用对比评吸法进行感官质量评吸[24].

2 结果与讨论

2.1 菌株生长曲线和西柏三烯-4,6-二醇降解曲线分析

菌株生长曲线和西柏三烯-4,6-二醇降解曲线如图1所示.由图1可以看出，在0～20 h，嗜麦芽窄食单胞菌生长迟缓，西柏三烯-4,6-二醇的降解率变化不明显.从20 h开始，嗜麦芽窄食单胞菌进入快速增长期，西柏三烯-4,6-二醇的降解率显著下降，这主要是因为西柏三烯-4,6-二醇作为碳源开始被菌株大量利用以维持自身的繁殖生长.随着代谢产物的累积，嗜麦芽窄食单胞菌的生长率与死亡率在培养36 h后达到平衡，表现为其菌株数量总体不变并保持稳定；之后，随着嗜麦芽窄食单胞菌死亡率的增加，逐步进入衰亡期，西柏三烯-4,6-二醇的降解率基本不再变化.因此，在后期培养基优化过程中，以36 h作为最佳培养周期.

图1 菌株生长曲线和西柏三烯-4,6-二醇降解曲线

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 碳源碳源对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响如图2所示.由图2可以看出，在不添加任何外加碳源的情况下，发酵菌液的OD600只有0.24，表明菌株未达到旺盛生长期，而西柏三烯-4,6-二醇的降解率也只有73.4%.在培养基中添加不同碳源后，西柏三烯-4,6-二醇的降解率表现为：添加麦芽糖时的降解率最高，可达84.0%，明显优于其他碳源，发酵菌液OD600为0.65，表明菌株达到旺盛生长期；而添加乳糖时的降解率最低，仅为38.2%.故最佳碳源为麦芽糖.

图2 碳源对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响

不同质量浓度的麦芽糖对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响如图3所示.由图3可以看出，不同质量浓度的麦芽糖对西柏三烯-4,6-二醇的降解率有较为明显的差异.在0～2.0 g/L质量浓度范围内，西柏三烯-4,6-二醇的降解率随麦芽糖质量浓度的增加而增加；在质量浓度为2.0 g/L时，西柏三烯-4,6-二醇的降解率和发酵菌液OD600达到最高值，分别为85.9%和0.69，表明菌体生长较好；但随着麦芽糖质量浓度的不断增加，西柏三烯-4,6-二醇的降解率和发酵菌液OD600均迅速下降，这可能是因为随着麦芽糖质量浓度的增加，培养基的渗透压随之升高，而渗透压过高会抑制菌体的生长及降解酶的合成.因此，选择麦芽糖质量浓度为2.0 g/L较适宜.

图3 不同质量浓度的麦芽糖对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响

2.2.2 氮源氮源对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响如图4所示.由图4可以看出，在培养基中添加无机氮源时，西柏三烯-4,6-二醇的降解率明显高于添加有机氮源时的降解率.其中，当以硫酸铵为氮源时，西柏三烯-4,6-二醇的降解率最高，达到88.6%，明显优于其他氮源，发酵菌液OD600为0.73，表明菌株生长旺盛；当以尿素为氮源时，西柏三烯-4,6-二醇的降解率和发酵菌液OD600均最低.故最佳氮源为硫酸铵.

图4 氮源对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响

不同质量浓度的硫酸铵对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响如图5所示.由图5可以看出，在0～2.0 g/L质量浓度范围内，西柏三烯-4,6-二醇的降解率随硫酸铵质量浓度的增加而增加，发酵菌液OD600总体也呈增加的趋势；当质量浓度大于2.0 g/L时，由于培养基pH值的升高，菌体繁殖加速，导致代谢产物的生成量较少.因此，选择硫酸铵质量浓度为2.0 g/L较适宜.

图5 不同质量浓度的硫酸铵对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响

2.2.3 初始pH值不同初始pH值对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响如图6所示.由图6可以看出，当初始pH值为5时，菌体基本不生长，这导致西柏三烯-4,6-二醇的降解率也很低；当初始pH值范围为5～8时，发酵菌液OD600随pH值的升高也逐渐增加，菌体开始旺盛生长，西柏三烯-4,6-二醇的降解率也随之增加；当初始pH值为8时，西柏三烯-4,6-二醇的降解率和发酵菌液OD600均达到最大值，分别为87.0%和0.73；当初始pH值大于8时，培养基的碱性过强，不适合菌株的生长及降解产物的积累，从而导致发酵菌液OD600和西柏三烯-4,6-二醇降解率的下降.因此，选择发酵培养基初始pH值为8较适宜.

2.2.4 培养温度不同培养温度对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响如图7所示.由图7可以看出，当培养温度为 25 ℃ 时，西柏三烯-4,6-二醇的降解率只有57.6%；随着培养温度的升高，菌体旺盛生长，发酵菌液OD600和西柏三烯-4,6-二醇降解率随之增加；当培养温度为40 ℃时，西柏三烯-4,6-二醇降解率达到88.7%，发酵菌液OD600也最大，为0.73；当培养温度超过40 ℃时，由于温度过高，菌株体内蛋白酶的活性下降，致使发酵菌液OD600和西柏三烯-4,6-二醇的降解率均有一定程度的下降.因此，选择发酵培养基培养温度为40 ℃较适宜.

图7 不同培养温度对西柏三烯-4,6-二醇降解率和发酵菌液OD600的影响

2.3 菌制剂发酵烟叶前后香味成分变化分析

对比发酵前后烟叶中的香味物质，发现约有15种烟叶香味物质的质量浓度发生了明显变化.经过仔细甄别，上述发生变化的香味物质中共有5种确定了分子式，分别为茄酮、5-异丙基-6-甲基-庚-3,5-二烯-2-醇、9-羟基-4,7-巨豆二烯-3-酮、叶绿醇和2,2′-(1,2-乙二基)双[6,6-二甲基]-双环[3.1.1]庚-2-烯.这5种变化明显的香味物质在发酵前后烟叶中质量浓度的变化见表1.由表1可知，叶绿醇的质量浓度下降，其他4种香味物质的质量浓度增加.其中，对香气组成影响较大的茄酮和9-羟基-4,7-巨豆二烯-3-酮的质量浓度增加较明显.

表1 5种变化明显的香味物质在发酵前后烟叶中质量浓度的变化

烟叶发酵过程中西柏三烯-4,6-二醇降解率的变化见表2.由表2可知，随着发酵时间的延长，西柏三烯-4,6-二醇的降解率逐渐增加，当菌制剂添加量为5.00%时，在发酵第 4 d，西柏三烯-4,6-二醇的降解率达到80%，在发酵第8 d达到87%.随着菌制剂添加量的减少，西柏三烯-4,6-二醇的降解率迅速下降，例如，在添加量为1.00%，发酵4 d时，西柏三烯-4,6-二醇的降解率为50%.在发酵过程中发现，发酵到第6 d时有部分烟叶发生了霉变及颜色明显加深，这可能是由于水分含量较大所致.综上所述,选择发酵时间为4 d，菌制剂的添加量为5.00%.

表2 烟叶发酵过程中西柏三烯-4,6-二醇降解率的变化

2.4 感官质量评吸结果分析

发酵前后烟叶感官质量评吸结果见表3.由表3可知，与发酵前烟叶相比，菌制剂发酵后的烟叶总评分提高了1分，其中，在香气质、香气量及香气浓度这3个方面的评分提高较明显，分别提高了0.3分、0.3分和0.4分.这与发酵后烟叶香味成分中茄酮和9-羟基-4,7-巨豆二烯-3-酮这两种烟叶中重要香味物质质量浓度的增加有关.因此,初步推测可能是由于嗜麦芽窄食单胞菌制成的菌制剂在发酵烟叶时，将烟叶中的西柏烯类物质降解，生成了茄酮类的重要香味物质，使发酵后烟叶的吸味品质得到提升.

表3 发酵前后烟叶感官质量评吸结果

3 结论

本文通过单因素试验对嗜麦芽窄食单胞菌的培养基进行了优化，优化后培养基中适宜的碳源为质量浓度为2.0 g/L的麦芽糖，氮源为质量浓度为2.0 g/L的硫酸铵，初始pH值为8，培养温度为40 ℃.将能高效降解西柏三烯-4,6-二醇的嗜麦芽窄食单胞菌制成菌制剂后用于发酵烟叶，经GC-MS检测分析发现烟叶发酵后有5种香味物质的质量浓度发生了明显变化，其中对香气组成影响较大的茄酮和9-羟基-4,7-巨豆二烯-3-酮的质量浓度均有不同程度的增加.将经菌制剂发酵的烟叶制成卷烟进行评吸，发现总分较发酵前提高了1分，其中香气质、香气量和香气浓度分别提高了0.3分、0.3分和0.4分.

本文利用嗜麦芽窄食单胞菌发酵烟叶可提升卷烟的香气量和香气质，理论上证明了利用微生物发酵烟叶以提升其品质的可行性，并为该类研究奠定了基础.后期拟继续优化烟叶发酵参数及研究发酵机制，以期缩短发酵时间，提升发酵效果，为利用微生物发酵烟叶的实际应用打下基础.