马铃薯蛋白高效提取分离技术优化

张亚军，王玉杰，张 龙，王 鹏，张建强

(甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

前言

我国马铃薯种植面积已达到670×104hm2，约占世界马铃薯种植面积的25%，己经成为世界马铃薯第一生产大国[1]。因此，我国马铃薯中营养物质的提取分离及其衍生物生产的产业迅速发展，但同时面临着严重的环境污染问题。目前，我国马铃薯淀粉生产企业己有千余家，平均每生产1t的淀粉就产生大约20t的工业废水，其中有5t左右是含有丰富蛋白质的有机废水，其中仅有少数企业回收有机废水中的蛋白质，用于动物饲料，大多数均直接排放，这不仅使大量的可食用性资源得不到很好的利用也对环境造成严重破坏[2]。

本实验以模拟马铃薯生产淀粉废水为原料，以不同方法回收可食用性马铃薯蛋白质，优化实验条件，使对马铃薯蛋白的提取率不断提高，促进马铃薯深加工，延长马铃薯产业链，以减轻污水直接排放对环境造成的污染。

1 材料

1.1 材料与试剂

市售马铃薯。

海藻酸钠、氢氧化钠、氯化氢、十二烷基苯磺酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等均为分析纯。

1.2 仪器

组织捣碎机、漩涡混合器、磁力搅拌机、水浴恒温振荡器、直流稳压电泳仪、垂直板型电泳、脱色摇床、分析天平、离心机、水浴锅、紫外分光光度计等。

2 实验方法

2.1 马铃薯蛋白质的提取

市售马铃薯清洗干净去皮切块。按薯与水的质量比(1∶2)用组织捣碎机将其磨碎成浆，静置15min,用四层纱布过滤，滤液4℃静置2h后,在6000r/min转速下离心10min,取上清液作为实验水样(SPWE)。在打浆过程中加入1%NaHSO3防止被氧化呈褐色[3]。

2.1.1 海藻酸钠法回收马铃薯蛋白质

准确量取100mL SPWE置于4个烧杯中，加入海藻酸钠的量分别为SPWE的0.1%，0.15%，0.2%，0.25%[4]，调至一定pH，不同海藻酸钠百分含量下设4个pH梯度(3.8、4.2、4.6、5.0),50℃下在恒温水浴振荡器中保持40min，在4000r/min的条件下离心15min，弃沉淀，测量并记录上清液体积，所得上清液富含马铃薯蛋白。

2.1.2 酸碱沉淀法回收马铃薯蛋白质

准确量取100mL SPWE分别置于4个烧杯中，用1mol/L NaOH溶液调节pH呈碱性(7.5、8.0、8.5、9.0)[5]，常温下沉淀1h后，6000r/min离心15min，上清液分别用1mol/L HC1溶液调节pH呈酸性，每个碱梯度下设4个酸梯度，分别为(3.8、4.2、4.6、5.0)，常温下沉淀10min，8000r/min离心15min，弃沉淀，测量并记录上清液体积，所得上清液富含马铃薯蛋白。

2.2 Bradford法测定蛋白质浓度

以牛血清蛋白制作标准曲线[6]。取七个试管，分别加入100ug/ml的标准蛋白质溶液：0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，不足1.2ml的部分用无离子水补足，再分别加入4ml考马斯亮兰G-250试剂，其中一号管为对照管。每加完一管，立即在旋涡混合器上混合，待5min后，在紫外分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值。以吸光值为纵坐标，蛋白含量为横坐标做标准曲线。取提取好的蛋白上清液2ml，加2ml考马斯亮兰G-250试剂。5min后，在分光光度计上测定样品在595nm处的光吸收值[7]。根据A595值，在标准曲线上查出样品的蛋白含量。

2.3 SDS-PAGE检测蛋白纯度

参考胡能书和万贤国的制备分离胶、浓缩胶方法，浓缩胶T=3.75%，分离胶T=7.5%[8]。在电泳槽中加入pH=8.3的电极缓冲液，每空加样品处理液10ul。接通电源后调节电压为100V，电流为50mA。当蛋白质跑到分离胶处，电压调至200V，电流不变，当处理液带跑至距分离胶下沿1cm处停止电泳[9]。

3 结果与分析

3.1 紫外分光光度法分析马铃薯蛋白含量

3.1.1 海藻酸钠法回收马铃薯蛋白分析

由图1可知，在pH=3.8的条件下，海藻酸钠含量由0.1%增加到0.25%，蛋白质含量先增加后减少，且以海藻酸钠含量为0.2%时，蛋白质含量最高；在pH=4.2的条件下，随着海藻酸钠百分含量的增加，蛋白质含量先增加后减少，且以海藻酸钠含量为0.15%时蛋白含量最高；在pH=4.6的条件下，随着海藻酸钠百分含量增加，蛋白质含量先减少后增加，且以海藻酸钠含量为0.1%时蛋白含量最高；在pH=5.0的条件下，随着海藻酸钠百分含量增加，蛋白质含量持续降低。

当海藻酸钠含量为0.1%，0.15%或0.25%时，在4个pH梯度下，pH=4.2时，蛋白质含量均为最高；当海藻酸钠含量为0.20%时，在4个不同pH梯度下，pH=3.8时，蛋白质含量最高(如图1)。

综合以上两个因素分析可知，当加入的海藻酸钠含量为0.15%-0.20%，且pH值在3.8时，或海藻酸钠含量为0.20%，且pH值在4.2时，蛋白质的含量均较高，即提取率较高，与其他条件下所提取蛋白的含量差异显著(如图1)。

图1 加入不同百分含量海藻酸钠，设置不同pH值对所提取蛋白含量的影响

3.1.2 酸碱沉淀法回收马铃薯蛋白分析

由图2可知，当pH=7.5时，在4个不同的酸梯度下，当pH值由3.8增加到5.0时，蛋白质含量先增加后减少再增加，且以pH=5.0时蛋白质含量最高；当pH=8.0时，在4个不同的酸梯度下，当pH值由3.8增加到5.0时，蛋白质含量先减少后增加再减少，且以pH=4.6时蛋白质含量最高；当pH=8.5时，在4个不同的酸梯度下，当pH值由3.8增加到5.0时，蛋白质含量先减少后增加，且以pH=5.0时蛋白质含量最高；当pH=9.0时，在4个不同的酸梯度下，当pH值由3.8增加到5.0时，蛋白质含量先减少后增加再减少，且以pH=4.6时蛋白质含量最高。

固定酸度pH值进行分析发现，当pH=3.8时，在4个不同碱梯度下，当pH值由7.5增加到9.0，蛋白质含量先增加后减少，且以pH=8.0时蛋白质含量最高；当pH=4.2时，在4个不同碱梯度下，当pH值由7.5增加到9.0，蛋白质含量先减少后增加再减少，且以pH=8.5时蛋白质含量最高；当pH=4.6时，在4个不同碱梯度下，当pH值由7.5增加到9.0，蛋白质含量先增加后减少，且以pH=8.0时蛋白质含量最高；当pH=5.0时，在4个不同碱梯度下，当pH值由7.5增加到9.0，蛋白质含量先增加后减少，且pH=8.0时蛋白质含量最高(如图2)。

综合以上两个因素分析可知，碱沉淀pH值为8.0、酸提取pH值为4.6和5.0时，或碱沉淀pH值为8.5时，酸提取pH值为4.6时，蛋白含量均高，且与其他条件下所提取蛋白的含量差异显著(如图2)。

图2 不同酸碱范围的pH值对所提取蛋白含量的影响

3.2 马铃薯蛋白电泳图谱分析

3.2.1 海藻酸钠法电泳图谱分析

图3a和图3b为不同海藻酸钠百分含量下及同一海藻酸钠百分含量的不同pH梯度下蛋白电泳图谱。由图3a可知，在海藻酸钠百分含量为0.15的任一pH梯度下比海藻酸钠百分含量为0.10的条带都要清晰。在海藻酸钠百分含量为0.10时，随着pH梯度增加，条带的清晰度降低，表明蛋白含量降低，同时蛋白条代数减少，表明蛋白种类减少；在海藻酸钠百分含量为0.15时，随着pH梯度增加，条带的清晰度显著降低，表明蛋白含量降低[10]。

由图3b可知，在海藻酸钠百分含量为0.20的任一pH梯度下比海藻酸钠百分含量为0.25的条带都要清晰。在海藻酸钠百分含量为0.20时，随着pH梯度增加，条带的清晰度降低，表明蛋白含量降低；在海藻酸钠百分含量为0.25时，随着pH梯度增加，条带的清晰度显著降低，表明蛋白含量降低[11]。

综合以上两个因素分析可知，在海藻酸钠百分含量为0.15，pH值为3.8和4.2时条带较为清晰；在海藻酸钠百分含量为0.2，pH值为3.8时条带较为清晰；表明这三种提取条件下，蛋白提取率均最高。

a：1-12.海藻酸钠百分含量为0.15%；13-24.海藻酸钠百分含量为0.10% b：1-12.海藻酸钠百分含量为0.25%；13-24.海藻酸钠百分含量为0.20% 1-3，13-15为pH=5.0；4-6，16-18为pH=4.6；7-9，19-21为pH=4.2；10-12，22-24为pH=3.8图3 不同百分含量海藻酸钠下，采用不同pH值所提取蛋白电泳图谱

3.2.2 酸碱沉淀法电泳图谱分析

图4a和图4b为不同酸碱梯度下蛋白电泳图谱。由图4a可知，在碱梯度为8.0下的任一酸梯度下，其电泳条带都要比碱梯度为7.5的任一酸梯度下的电泳条带清晰，但提取到的蛋白种类较少。在碱度为7.5时，下设酸梯度增大，蛋白条带逐渐清晰，表明蛋白含量提高；在碱梯度为8.0时，下设酸梯度增大，蛋白条带先清晰后黯淡再清晰，且以酸梯度为4.6和5.0时条带最为清晰，表明蛋白含量最高。

由图4b可知，碱沉淀pH值为8.5时，条带7-9较为黯淡，可能是因为保存不周部分蛋白失活，其余电泳条带都要比碱梯度为9.0的任一酸梯度下的电泳条带清晰。当碱沉淀pH值为8.5时，随着下设酸梯度增大，蛋白条带显著变清晰，表明蛋白含量增加；当碱沉淀pH值为9.0时，随着下设酸梯度增大，蛋白条带由清晰到黯淡再到清晰，表明蛋白含量先减少后增加，且以pH为4.6和5.0时条带最为清晰，蛋白含量最高。

综合以上两个因素分析可知，碱沉淀pH值为8.0,酸提取pH值为4.6和5.0时条带较为清晰；碱沉淀pH值为8.5时，酸提取pH值为4.6时，蛋白条带较为清晰，表明蛋白含量高，提取效果佳。

a：1-12.碱沉淀pH为8.0；13-24.碱沉淀pH为7.5 b：1-12.碱沉淀pH为9.0；13-24.碱沉淀pH为8.5 1-3，13-15为pH=5.0；4-6，16-18为pH=4.6；7-9，19-21为pH=4.2；10-12，22-24为pH=3.8图4 不同酸碱范围的pH值下所提取蛋白电泳图谱

3.2.3海藻酸钠法与酸碱沉淀法混合点样电泳图谱分析

为检测不同百分含量的海藻酸钠和采用不同pH梯度进行酸碱沉淀得到的蛋白是否一致，本实验挑选了各处理下蛋白含量较高的样品进行了混合点样。如图5所示，所有条带均在一条直线上，并未见明显的条带分层现象，证明海藻酸钠法和酸碱沉淀法提取的为同种蛋白；且不同海藻酸钠百分含量下设不同pH梯度下提取的也为同种蛋白；且不同的酸碱梯度下提取的也为同种蛋白[12]。

1-3为加入海藻酸钠百分含量为0.15%，pH=3.8、4.2和加入海藻酸钠百分含量为0.20%，pH=3.8三种处理混合点样；4-5为碱沉淀pH=8.0，酸提取pH=4.6、5.0二种处理混合点样；6-8为加入海藻酸钠百分含量为0.15%，pH=3.8和碱沉淀pH=8.0，酸提取pH=4.6二种处理混合点样；9-11为加入海藻酸钠百分含量为0.15%，pH=4.2和碱沉淀pH=8.0，酸提取pH=4.6二种处理混合点样；12-14为加入海藻酸钠百分含量为0.20%，pH=3.8碱沉淀pH=8.0，酸提取pH=4.6二种处理混合点样；15-17为加入海藻酸钠百分含量为0.15%，pH=3.8和碱沉淀pH=8.0，酸提取pH=5.0二种处理混合点样；18-20为加入海藻酸钠百分含量为0.15%，pH=4.2和碱沉淀pH=8.0，酸提取pH=5.0二种处理混合点样；21-23为加入海藻酸钠百分含量为0.20%，pH=3.8碱沉淀pH=8.0，酸提取pH=5.0二种处理混合点样。图5 不同百分含量的海藻酸钠和不同pH梯度酸碱沉淀酸所提取蛋白混合电泳图谱

4 讨论

本研究表明，海藻酸钠法回收马铃薯蛋白的效果优于酸碱沉淀法。且在海藻酸钠百分含量为0.15-0.20时，pH值在3.8-4.2时，提取效果最佳，这与熊淑芳等对马铃薯提取淀粉后废水中蛋白质的回收利用研究结果相同[13]，也与潘牧等对马铃薯蛋白的研究进展研究结果相同[14]。酸碱沉淀法提取马铃薯中蛋白，碱沉淀pH值应在8.0-8.5之间，酸提取pH值应在4.6-5.0之间，回收效果最佳，这与任琼琼等对马铃薯淀粉废水中蛋白质的提取研究结果并不相同[15]，该研究表明碱度pH值在9.0左右，酸度pH值在4.0左右提取效果最佳，这可能与其它相关处理不同有关，如沉淀时间、离心时间等[16]。本研究将有助于回收马铃薯提取淀粉后废水中蛋白质的回收利用，减少对资源的浪费和环境的污染。