绿豆VrNAC转录因子鉴定及生物信息学分析

郭亚宁，张盼盼，罗 玉，陈润峰，张 雄

(榆林学院 生命科学学院 ，陕西 榆林 719000)

NAC是植物特有的较大转录因子家族之一，其命名起源于NAM、ATAF1/2和CUC1/2三类基因。随着多种植物的基因组测序完成，为NAC转录因子在基因组水平的分析奠定基础，在拟南芥、大豆和玉米中分别鉴定得到117[1]、150[2]和216[3]个家族成员，同时在棉花、卷心菜、毛果杨等植物中分别鉴定得到NAC转录因子，说明NAC转录因子在植物中具有广泛的作用[4]。近年大量研究表明NAC转录因子在植物生长发育及逆境应答中发挥着重要的作用，芒属中的MlNAC10基因能够提高拟南芥的抗旱能力[5]；狼尾草中的PgNAC21调控拟南芥对高盐的忍耐力[6]；香蕉MpSNAC67基因参与叶绿素合成途径[7]。综上可知，NAC蛋白作为植物特有的转录因子，对植物的生长具有普遍的调控作用。

绿豆(VignaradiataL.)是我国重要的食用豆类[8]，其籽粒富含蛋白质等营养物质，是高血脂、糖尿病人的优良食材[9]。绿豆基因组数据的公布[10]，为绿豆的分子相关研究奠定了数据基础。大量研究表明NAC转录因子在植物逆境生长发育中发挥着重要作用，但绿豆中关于NAC转录因子的研究匮乏，绿豆中的功能NAC亟待挖掘。本研究基于绿豆基因组数据，利用生物信息学方法，对绿豆中NAC转录因子进行核酸组成及结构分析、进化分析、聚类分析，保守结构域分析，初步鉴定得到绿豆功能NAC基因，为绿豆的分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 绿豆中VrNACs的鉴定

基于绿豆基因组数据(ftp://ftp.gramene.org/pub/gramene)，借助NCBI中拟南芥及水稻的NAC蛋白序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，通过本地Blast软件进行tblastn同源比对，设置E-value<1E-10，Identity>200，去冗余后，得到完整的CDs共59条，按照顺序命名为VrNAC1-VrNAC59，NCBI中对应编号见附表1。

1.2 VrNACs的染色体定位及保守结构域多重比对

利用DNAMAN软件，进行VrNACs的核酸分子量、长度及保守序列的多重序列比对分析；利用mapchart软件对VrNACs的染色体体定位信息进行可视化分析。

1.3 VrNACs的模体分析及ka/ks计算

利用MEME(http://meme-suite.org/)在线分析VrNACs的模体结构；通过KaKs Calculator软件，分析VrNACs在随着绿豆进化过程中的演替方向。

1.4 VrNACs的聚类分析

基于VrNACs氨基酸序列及拟南芥的137条ANACs，利用MUSCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)进行多重序列比对，构建聚类图。

2 结果与分析

2.1 VrNACs的基础结构分析

VrNACs的基础结构如表1所示。59条VrNACs基因的核酸长度分布于498～2919 bp之间；59条绿豆VrNACs序列的G/C含量较低，A/T的含量较高。

2.2 绿豆VrNAC序列的多重序列比对

利用DNAMAN软件，对59条VrNACs序列进行多重序列比对，结果见图1。绿豆的VrNAC序列的N端相对保守，长度在450 bp左右，根据其结构特征可以划分为A、B、C、D和E五个亚结构域[11]，其中C亚结构域保守性最高，可能是NAC转录因子与其他蛋白或下游DNA的结合的决定因子。绿豆VrNACs序列的C端差异显著，可能与NAC转录因子的转录激活活性相关，绿豆VrNACs基因的结构特征与其他植物的NAC转录因子的结构特征一致。

图1 159条VrNACs的多重序列比对

2.3 VrNACs的染色体定位

根据绿豆基因组数据，利用mapchat软件对59个VrNACs基因的染色体定位进行可视化分析，结果见2。除VrNAC1-VrNAC6、VrNAC23、VrNAC24、VrNAC28、VrNAC29和VrNAC44分别定位到scaffold_7、43、48、51、86、137、179、312、341和425上，其余48个基因均准确定位于绿豆的11条染色体上，其中9号染色体无VrNAC基因分布，4号和10号染色体分别仅包含VrNAC30和VrNAC58，1号、5号和7号染色体的VrNACs基因分布较多，2号和6号染色体上各包含5个VrNACs基因，3号、8号和11号染色体分别有3个VrNACs基因分布，该结果表明VrNACs在绿豆11条染色体非均匀分布。

2.4 VrNACs的模体分析

利用MEME在线软件分析59条VrNACs的模体组成，结果见图3。VrNACs的模体数量及相对位置存在较大的差异，且VrNACs的6个模体大部分存在于N端。其中VrNAC07、VrNAC09、VrNAC12、VrNAC53、VrNAC50、VrNAC05和VrNAC20聚类到同一分支，均包含3个不连续模体；VrNAC33、VrNAC14、VrNAC44、VrNAC28、VrNAC35、VrNAC04、VrNAC22和VrNAC41均包含5个不同的模体。

图2 VrNACs的染色体定位分析

图3 绿豆VrNACs的模体分析

图注：Chr1-chr11分别代表绿豆基因组标注的1-11号染色体。

2.5 VrNACs的ka/ks分析

通过KaKs_Calculator软件计算7对VrNACs基因的ka/ks比值，结果见表3。7对VrNACs基因的相似性均大于45%，其中VrNAC13-VrNAC52、VrNAC32-VrNAC43、VrNAC08-VrNAC45、VrNAC12-VrNAC53和VrNAC37-VrNAC48的ka/ks比值均大于1，为正选择过程；VrNAC25-VrNAC55和VrNAC03-VrNAC17均小于1，为纯化选择过程。

表3 VrNACs的ka/ks值

2.6 VrNACs和ANACs的氨基酸序列的聚类分析

利用MEGA软件对拟南芥和绿豆的NACs序列进行聚类分析，结果如图4所示。196个NACs共聚为7个亚类，分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ。59个VrNACs非均匀地分布到7个亚类中，其中Ⅰ亚类包含7个VrNACs；亚类Ⅱ包含绿豆VrNAC57和5个拟南芥的NAC蛋白；第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ亚类亚类分别包含9、8、13、6、15个绿豆VrNACs。

图4 59个VrNACs和137个ANACs的氨基酸序列聚类分析

3 讨论

绿豆中的59个VrNAC基因N端保守，保守区域长度约150aa，C端变异较大，表明其N端涉及VrNAC蛋白靶向下游因子的准确性，C端变异较大说明绿豆VrNACs蛋白在功能上存在显著性差异；绿豆VrNAC基因集中分布在1、2、5、6、7号染色体上，9号染色体无分布，其余染色体分布较少，同时位于同一染色体的VrNACs具有相似的模体结构，属于同一亚类，推测VrNACs在随着绿豆的进化过程中发生复制和变异是非均衡的，且同一染色体上的VrNACs通过共同的祖先，经过多次复制、变异产生多个相似基因[12]。聚类结果表明绿豆的VrNACs非均匀分布于7个亚类中，根据结构决定功能的原理，结合拟南芥中NAC蛋白在植物生长发育及逆境胁迫中的功能多样性，推测绿豆的VrNACs可能参与绿豆的生长发育及逆境胁迫应答。