核桃细菌性黑斑病研究进展

陈雯雯 毛雅慧 李峰

摘 要： 核桃具有丰富的营养价值以及保健功能，是重要的经济林树种。核桃病害有30多种，核桃细菌性黑斑病是核桃生产中最主要的病害之一，在我国乃至世界范围内广泛流行。其病变特征多样，果实受害程度最为严重，严重影响了核桃的产量和品质。本文针对其危害症状、病原物、侵染机制、病原菌基因分型及遗传多样性、致病机理、病害防治等方面进行概括性综述，旨在为核桃细菌性黑斑病的深入研究以及开发新的绿色生防药剂提供理论参考，并在深入分析国内外研究现状的基础上，提出对核桃细菌性黑斑病未来的研究方向和应用前景的展望。

关键词： 核桃;核桃细菌性黑斑病;病原菌;病害防治

中图分类号：S436.64   文献标识码：A   文章编号：1004-3020（2021）02-0047-07

Progress on Walnut Bacterial Black Spot

Chen Wenwen（1，2） Mao Yahui（2） Li Feng（1）

（1.School of Life Science and Technology，Hubei Engineering University Xiaogan 432000;2.Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables，Hubei Engineering University Xiaogan 432000）

Abstract： Walnuts are an important non-timber forest species，rich in nutritive value and health care function.There are more than 30 types of walnut disease，and bacterial black spots of walnut are one of the most important diseases in walnut production.It is widespread in my country and even the world.Its pathological characteristics are diverse，and the fruit suffers the most serious damage，which seriously affects the yield and quality of walnuts.The authors provides a general review of its harmful symptoms，pathogens，infection mechanism，pathogen genotyping and genetic diversity，pathogenic mechanism，disease prevention，etc.，aiming to provide in-depth research and development of new walnut bacterial black spot disease.The green biocontrol agents provided theoretical reference，and on the basis of in-depth analysis of the research status at home and abroad，put forward the future research direction and application prospects of walnut bacterial black spot.

Key words： Juglans regia;walnut bacterial black spot;pathogens;disease control

核桃Juglans regia因其具有丰富的营养价值及保健功能位居世界坚果之首，是重要的经济林树种，也是我国分布范围最广、栽培历史最悠久的干果树种和木本粮油树种[1]，同时中国也是世界核桃原产中心之一[2]。截止2015年栽培面积占全球49.1%，居全球栽培面积和产量首位，截止2018年国家林业局公布了74个国家级核桃示范基地名单[3]。近年，随着中国核桃果树栽培面积的增加加重了管理难度、栽培经营方式的转变使核桃生长生态环境发生变化，以及大面积对早实薄皮核桃品种的推广[4，5]等因素加剧了核桃病虫害的发生。核桃病害种类繁多，严重影响着核桃的产量和品质，目前已知核桃病害有30多种，而其中最为严重的病害是炭疽病，黑斑病和溃疡病。核桃细菌性黑斑病Walnut bacterial black spot，又称核桃细菌性疫病Walnut bacterial blight，是世界性核桃病害。其病变特征多样，侵染叶片形成近圆形或多角形病斑，侵染严重时可导致叶柄、枝条坏死，但主要侵染核桃果实，出现中央稍凹陷黑斑，并可引起严重的幼果脱落[6，7]，导致核桃出仁率以及核桃仁含油量降低，影响核桃产业的发展，给果农造成巨大的经济损失。本文综述了核桃细菌性黑斑病的国内外进展并展望其未来的应用前景，对我国经济林研究、研发新的绿色生防药剂等具有重要的指导意义。

1 发生与危害

自19世紀末核桃细菌性黑斑病就被人们所认知，并在核桃种植区广泛流行，对叶片、嫩枝、芽、叶柄、花轴、雌雄花序、果核和籽粒造成严重损害，被认为是导致果实产量和树木活力下降的一个主要原因[8]。该病在我国多省主要的核桃产区均有发生，且近年来危害严重程度有增加趋势[9]。据近几年报道，2017年山东省济南市南部核桃种植区发病面积为0.34万hm2，果实患病率高达42%，减少产量约40%，给果农造成直接经济损失2 500余万元[10]。2018年对陕西省商洛市核桃种植区设立7个调查点，共随机调查果实2 385个以及2 100个1～3 a生枝条，遭受细菌性黑斑病危害的果实共有420个，占总体的17.6%;遭受细菌性黑斑病危害的枝条有578个，病害率达27.5%[11]。2013～2015年甘肃省临夏州东乡和临夏两个核桃种植区的果实被害率为30%～56%[12]。

2 病害症状

核桃细菌性黑斑病，之所以又称为核桃细菌性疫病，是因其所表现的症状主要为引起核桃树的枯萎，该病使核桃叶片、花、嫩梢及果实受到严重危害，受害程度最高的部位为核桃果实[13]。其病害主要症状表现为有黑色斑点出现在叶脉及叶脉的分叉处，有半透明状晕圈的黑褐色病斑随后出现在外缘部;叶柄和枝梢上出现有且多呈长圆形或不规则形褐色病斑。枝条受到病害后所形成的病斑与时节相关，一般可分为2类：一是多发于春季，呈暗褐色小型疮疹，可使枝干枯萎;二是多发于夏季，呈水渍状圆形暗紫色斑点;受到病害的幼果会在表面出现黑褐色小斑点，后形成下陷的面积较大的圆形或不规则形黑色病斑[14]，有水渍状晕圈在病斑外围，病菌在果壳未硬化时可扩展至核仁，致使果实发黑早期脱落，随着果壳变硬，核仁会受到的影响也不同。受到病害后，芽发黑枯死;花轴变黑扭曲;花序变黑凋萎随后枯萎早落。在法国核桃上出现的一种新的细菌性病害，被称为垂直渗出性溃疡（VOC），其在核桃叶和果上表现出的症状与核桃枯萎病极为类似，但VOC（垂直渗出性溃疡）还包括树干和枝条上的溃疡[15]。

3 病原物

研究者对核桃黑斑病病斑物进行培养，通过分离纯化，发现核桃黑斑内有黄单胞杆菌属（专化寄生核桃生理小种）、成团泛菌Pantoea agglomerans以及链格孢菌Alternaria spp.等，因此，一般认为核桃黑斑病是多种病菌复合侵染和协同作用的结果。不同病原的致病力、发病时间不同。而引起黑斑病的细菌性病原主要有：野油菜黄单胞菌核桃致病变种Xanthomonas campestris pv.juglandis、地毯草黄单胞核核桃致病变种X.axonopodis pv.juglandis、树生黄单胞菌核桃致病变种X.arboricola pv.juglandis[16]。多数病变部位分离得到的细菌鉴定为树生黄单胞菌核桃致病变种（简称Xaj）（由于病原菌的分类地位发生变化，以前的文献中与此学名不一致），为专属寄生的革兰氏阴性菌，菌体短杆状，大小（1.5～3.0）μm×（0.3～0.5）μm，极生单鞭毛，能形成生物膜，有荚膜，好气性，在固体培养基上形成黄色、圆形菌落，表面凸起光滑，能产多糖[17];黄色素分泌较多;有较强的耐盐性;对纤维素和淀粉都有较强的分解能力;有一定的趋化作用[18];病菌生长温度在7～38 ℃范围内，25 ℃为最佳温度，致死条件为51～52 ℃、时长10 min，在干燥条件下可存活10～13 d，在枝梢溃疡组织内可存活1年以上[19]。王瀚[20]等对典型病斑的叶片与病果采用形态学和16SrDNA序列分析以及进行病原菌的分离纯化，完成柯赫氏法则验证，认为革兰氏阴性，黄单胞杆菌Xanthomonas campestris是引起陇南市成县核桃产区核桃黑斑病的主要病原菌。

4 侵染机制

带病菌种子是该病的主要传播途径，且病原菌扩散速度较快。病菌存在于病枝和残留病果上，一般在休眠芽、树枝溃疡和被遗传或留在树上受到感染的果实中越冬[21]，病原菌可通过风雨传播到果树的幼叶、幼果、嫩枝及花粉上，其次，昆虫也可作为病菌的媒介对苗木和接穗等进行远距离传播[22]。细菌侵染果树的方法多样，可通过风雨、流水或农事操作等传播;也可从自然孔口侵入，例如气孔、皮孔、柱头等;也可从害虫危害后的伤口、机械伤口等侵入，病菌在气孔充分开放或伤口多，表面潮湿的情况下，更加利于侵入[23];核桃疫病流行病学调查中发现只需保持5分钟的叶片湿度就足以使病原菌X.arboricola pv.juglandis侵染水淹的核桃幼果[24]。核桃展叶期至花期是最容易受到病害时期，高温干旱天气可抑制病情的发展，雨期使得病情扩展加重[21，22]，因为深山区中空气湿度大、温度低，通风透光条件差和丰富的树下植被，这些条件充分的给核桃黑斑病的发生提供便利，所以核桃黑斑病在深山区的发病率要高于浅山区和平原区[25]。侵染程度受多种条件因素影响，如在一些含有薄壳品种、树木抗病性弱、老龄树、常有虫害发生等条件的植株或地区，细菌性黑斑病发病情况较重。另外，孙俊[26]以接近田间自然发病条件为基础对12个品种（系）的核桃苗接种病原菌进行试验，结果表明，各品种间受到病害侵染差异较大，说明核桃品种也是影响病害侵染的原因之一。

5 病原菌的遗传多样性

目前，国内外有关核桃细菌性黑斑病病原菌的研究报道多集中于病原菌的发病规律[27]、基因分型[28]，研究其遗传多样性及地域来源差异[29，30]。欧洲是全球核桃的发源地以及重要产地之一，多年来，大量学者在核桃细菌性疫病菌的遗传多样性方面进行研究。Burokiene等人通过BOX、ERIC和REP引物产生rep-PCR基因组和MLST的方法，分别分析了来源于波兰和立陶宛的核桃细菌性疫病病原菌，结果表明病原菌在地理位置上存在差异[31]。 Ivanovic等人通过ERIC引物产生rep-PCR基因组和脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法，分析了来自塞尔维亚不同地区的病原菌的基因组指纹图谱，结果显示有3个明显的聚类群[32]。Kaluzna等人同样通过rep-PCR基因组和MLST的方法，对分别来自波兰6个地区的叶片及果实病样进行了多样性分析，表明它们的遗传多样性不同于法国、葡萄牙和英国的菌株[33]。陈善义[34]等对北京地区核桃种植区的病变植株利用组织分离法分离核桃细菌性黑斑病菌，并对分离的菌株的16S-rDNA序列测序以及同源比对分析，结果表明，该菌株16S-rDNA由1 453个核苷酸组成，该菌株与黄单胞杆菌相似性达99%，确认为Xanthomonas campestris。傅本重[35]等分離纯化了在湖北省内不同核桃园中的不同核桃的病变组织，选取其中有代表性的22个菌株进行16S-rDNA序列分析，结果表明，湖北省不同地理来源和病组织的菌株存在一定的遗传多样性。由于黑斑病病原菌具有遗传多样性特点，Camila Fernandes等建立了快速鉴定Xaj分离株并在受感染植物材料中检测出这些病原物的可靠分子方法[36]，研究者设计并通过专用的计算机方法选择了九种新的特异性DNA标记（XAJ1至XAJ9），这9个Xaj特异性标记将DNA检测分析的特异性与分型分辨率相结合，有助于快速检测和鉴定潜在的具有毒性的Xaj基因型，推断其分布，揭示这种植物病原体潜在的选择性宿主物种和提高植物检疫效率。通过对不同地域致病核桃样品的采集和调查，分离其病原菌进行鉴定，旨在搞清某地区核桃细菌性病害发生的基本规律，为综合防治提供一定的参考价值。

6 致病机理

研究病原微生物的生理特性和致病机理，全面解析植物病原微生物与植物互作机制，对于寻找新型高效的病害防治方法具有重要的指导意义。目前，国内外对核桃细菌性黑斑病菌的致病机理并未形成系统研究，关于病原菌相关致病因子、毒力分泌系统、分泌蛋白功能的研究报道较少。

黄单胞菌属Xanthomonas arboricola通常为植物病原细菌，但有研究表明，X.arboricola中还包含在其宿主上不会引起明显病症的非致病性细菌。Salwa Essakhi等人评估了与核桃相关的X.arboricola种群结构，发现一些非致病性的X.arboricola菌株不包含典型的III型分泌系统（T3SS），仅包含1～3个III型效应子（T3E）编码基因，甚至有些非致病性菌株中未检测到T3SS基因，这表明T3E基因是使X.arboricola具有致病性的原因[37]。该项研究有助于更好地了解非致病性Xanthomonads在核桃微生物群中的作用。

近年来，VI型分泌系统（Type VI secretion system，T6SS）被发现是一种广泛分布在革兰氏阴性菌中的新型分泌系统，由Hcp（溶血素环状蛋白家族）和VgrG（缬氨酸-甘氨酸重复序列家族）两种标志性蛋白质构成，Hcp/Vgr复合体的功能尚不清楚，推测这两种蛋白是分泌系统的细胞外结构组分;另一种保守的T6SS基因产物是ClpV，ATP水解酶家族成员，为系统运作提供主要能量来源[38，39]。野油菜黄单胞X.campestris、稻黄单胞菌X.oryzae的T6SS由14个核心基因组成[40];目前关于地毯草黄单胞菌X.axonopodis的分泌系统的研究主要集中在T3SS、T4SS和T5SS，而对最新发现的T6SS的研究还未见文献报道[41]。

祝友朋[42]等学者以云南省大理州核桃主产区核桃为研究对象，以全基因组序列已经公布的7个核桃细菌性黑斑病菌菌株所具有的蛋白序列为预测依据，利用在线分析程序对其分泌蛋白进行预测，同时对其氨基酸组成及分布、理化性质、结构等特征进行了分析。此研究有效地实现了核桃细菌性黑斑病菌中分泌蛋白的预测和生物信息学分析，并为深入研究细菌性黑斑病菌分泌蛋白质的功能奠定基础[43]。

利用比较基因组学对黄单胞菌属的致病性和非致病性菌株进行分析，能够揭示与病理适应性相关的分子进化过程。例如，Sophie Cesbron课题组利用比较基因组学和生理学测试检测了从核桃树上分离出的四个X.arboricola菌株间的差异：全基因组序列比较显示，致病菌比非致病具有更大和范围更广的移动遗传元件，致病性菌株中III型效应元件的数量比非致病性菌株的多;另外还鉴定出了两类菌株间化学受体和粘附素编码基因的差异[15]。

7 病害防治

7.1 抗病品种选择

根据众多学者的调查研究发现各核桃品种间对细菌性黑斑病的抗性存在差异性，所以规避病害风险的有效途径之一是采用高抗性品种。牛亚胜等[44]通过标准差法分别对20个核桃品种（系）抗黑斑病的能力进行研究，结果表明‘陇32和‘西林为高抗品种，‘中林3和‘香玲为高感品种。孙俊研究发现，‘辽7号品种果树发病率最低，是核桃黑斑病抗性最好的品种，，而‘30301品种发病率则高达74.17%[26]。蒋时姣[45]等人于2016年和2017年在中国四川成都评估了18种不同基因型的核桃品种对致病菌Xanthomonas arboricola pv.juglandis（Xaj）的抗性，研究中使用了三种测定法：田间调查（作为测定标准），离体小叶测定和全株测定法。结果显示“JS 91”“JS 92”“JS 86”“清香”和“JS 71”这五个基因型在所有测试中均表现出部分抗性，可作为候选进行下一步评估。尽管田间现场调查与小叶测定、全株植物测定之间存在显著相关性，但是，后两者并不能替代田间分析成为评估核桃对疫病抵抗力的主要方法。因此，在抗病品种的选择上，需要根据各核桃生产区环境条件及主要栽种品种，筛选出最适合本地区的抗病品种，需要注意的是同一品种的抗性在不同区域会表现不同。

7.2 农业防治

在栽培管理中可通过增施完全腐熟的有机肥来提高植株抗病性;保持果园内一定的温度及湿度，及时排水;合理确定栽培密度，保持果园通风透光;除了挑选品种抗性高的果树外还要增強果树的抗病能力;在其生长过程中，及时发现清除病果、病叶;在核桃采收完成后要及时清理果园，将残留的病果、病枝等进行剪除并集中烧毁，以达到隔绝发病传染源的目的。此外，在果树中，李树、杏树以及樱桃尤为容易发生病害且传染性强，核桃不宜与其进行混栽[46]。

7.3 化学、生物防治

防治核桃细菌性黑斑病的四个关键时期分别是：发芽前期、展叶期和雌花期、果实成长期。发芽前期是预防性防治，防治措施主要是减少侵染源;展叶期和雌花期是受到病害的关键时期，要及时防治并提高防治效果，一般是通过喷洒化学药剂;在果实成长期主要以控制病菌的传播及病害发展为防治目的。目前，国内外对核桃细菌性黑斑病的发生采取了相应的防治措施，如利用噬菌体侵染[16]、外源喷洒含铜化学农药[47，48]、利用核桃植物内源性酚类化合物[49]及内生菌的拮抗作用进行的生物防治[50]等方法，起到了一定的防治效果。

一般使用以波尔多液为主的保护性铜制剂，配合用甲基托布津、代森锰锌、农用链霉素、青霉素钾盐等药剂对细菌性黑斑病进行综合防治[51]。雷明山等[5]对核桃黑斑病进行田间药效试验表明，1500倍液的3%噻霉酮可湿性粉剂、2500倍液20%苯醚甲环唑微乳剂和600倍液的50%退菌特可湿性粉剂对核桃黑斑病的防治效果较好。董贝[52]等人在进行核桃黑斑病防治试验中使用6种药剂，通过对比发现，15%络氨铜水剂对黑斑病的防治效果达78.35%，使核桃产量增加73.9%。通过室内毒力测定及盆栽试验，发现对核桃细菌性黑斑病病原物黄单胞杆菌Xanthomonas campestris pv.juglandis（PierceDowson）具有明显抑制效果的药剂为四霉素、链霉素、乙蒜素、中生菌素和春雷霉素。其中，四霉素和链霉素的抑菌效果最强，可作为防治核桃细菌性黑斑病的候选杀菌剂[53]。需要注意的是，四霉素虽然抑菌效果俱佳，但对人体具有较大毒性，因此需要慎重选择。

生物防治是一种绿色环保的病害防治方法。一些噬菌体被认为是强裂解（或毒性）的，能杀死受感染的细菌。其他的是温和的，其特征是在向原噬菌体转变的周期中，其基因组的复制将与细菌繁殖同步，并且可以在之后重新被激活[16]。Dora Domotor等学者认为控制细菌性黑斑病的一个潜在的解决办法是应用噬菌体[54]，他们从感染病菌的土壤和核桃气生组织中分离到的24个噬菌体中，选择两种多价噬菌体—Xaj2和Xaj24，并进行进一步的表征（包括基因组、生理和形态）分析，实验结果表明这两种噬菌体均表现出对病菌的溶解作用，其中Xaj24对叶缘焦枯病菌及黄单胞菌属细菌都具有毒性。另外，通过细菌之间的拮抗作用来预防和治疗一些重要的细菌性病害，这引起了国内外研究者的广泛关注[55-57]。王瀚等[58]学者通过平板对峙法在核桃树根际土壤中以陇南核桃黑斑病病原菌Xanthomonas campestris pv.campestris为靶细菌，筛选到抑菌率高达90%以上、拮抗效果极佳的节杆菌Arthrobacter sp.和莫海威芽孢杆菌Bacillus mojavensis，具有潜在开发利用价值。

7.4 其他防治方法

另外，有研究报道称可通过在发生病害的核桃林下套种豆科植物，如大豆、豌豆等，由于根瘤菌等共生微生物附着在豆科植物根系上，形成了生物物理屏障作用，绿肥中有益菌群对核桃树病原菌排斥并在空间上对病原菌的繁殖传播进行阻断，以达到防病增产的目的[59];豆科绿肥植物具有强固氮培肥能力，能够提供核桃生长所需要的氮素营养，从而提高了植株本身的抗病能力。

8 研究展望

近几年，我国局部核桃生产地区的细菌性黑斑病病害的发生随着种植面积不断扩大而愈发严重。目前，我国针对核桃黑斑病防治方面的报道尽管比较多，但是对于核桃黑斑病的研究还处于初步阶段，缺乏系统和深入地研究。我国采取的防治方法还都存在一定的局限性，如选育抗病品种过程繁琐而且周期过长;而对含内源性酚类化合物的抗性品种的选育与推广速度远远低于病原菌变异的速度，抗性品种的应用也只能是暂时和局部的;外源喷洒含铜化学农药（或铜锌制剂与抗生素类农药交替使用）的化学防治手段虽然是目前较为有效的黑斑病防治方案，但存在成本高，不能有效杀死病原菌，且长期使用还导致农药残留，造成抗铜细菌的滋生，引起食品安全及生态平衡破坏等弊端。因此，在病害的防治方面，不仅要借鉴国外防治措施，还需要根据不同核桃生产区的生长环境、品种特性、栽培管理方式等，进行有针对性的、综合性的科学防治。

病原菌的致病过程与典型的毒力因子直接相关[60]，毒力因子包括分泌系统、细菌霉素、黏附与侵袭和铁载体四大类[61]，黄单胞菌在寄主组织内的侵染和繁殖取决于分泌的多糖、脂多糖、粘附素和III型分泌系统以及其它毒力因子[62]，所以可通过对毒力因子的认识和研究进一步研发有效的疫苗和新型抗毒力因子药物。由于有多项研究通过对从核桃组织上分离到的致病菌和非致病菌基因组的比较，提出了关于非致病性菌株的起源和核桃致病菌植物致病性进化的问题，并发现和揭示了众多与致病性相关的基因组元件（如T3E），为核桃病原细菌的防治提供了可靠的理论依据，我们可以通过对这些毒力因子进行修饰改造，从而降低或消除病原菌的毒力。近年来，随着病原菌耐药性的提高，新型抗菌药物的研发变得越来越紧迫，研究表明，抗菌药物的设计和筛选与细菌脂肪酸合酶存在联系[63，64]。通过在脂肪酸合成途径中使用关键酶作为潜在的药物靶标来筛选可克服耐药性，高选择性和低毒性的抑制剂，已成为抗菌药物研究和开发的热点领域[65]。例如，3-酮脂酰ACP还原酶在细菌中高度保守，许多细菌的存活与催化脂肪酸合成的主要还原反应有关[66]，3-酮脂酰ACP还原酶抑制剂具有作为广谱抗生素的潜力，在分子水平上研究其反应机制将有助于药物的合理设计[67]。由于细菌脂肪酸合成具有多样性特点，同一细菌中具有多个拷贝的同功酶或具有多种类型的合成酶;不同细菌间的同个合成酶在底物专一性、结构和功能上都存在差异，因此脂肪酸合酶及其同系物的功能多样性还有待开发与鉴定。

目前，在核桃细菌性黑斑病菌脂肪酸合成代谢方面，国内外相关的研究报告十分罕见，关于脂肪酸合成代谢与该病原菌的致病性存在直接关系的研究报道更是未见，本课题组通过生物化学手段对野生型的核桃細菌性黑斑病菌的致病相关表型进行了初步研究[68]，发现该细菌具有群体运动性，胞外蛋白酶分泌能力较强，产胞外多糖和生物膜，对逆境（酸性及表面活性剂SDS条件下）具有一定的耐受性，这为深入研究病原菌的致病机理提供了一定的研究基础。另外，本课题组利用基因敲除原理，对核桃细菌性黑斑病菌体内的多个3-酮酯酰ACP还原酶同源基因逐一进行缺失突变，在成功筛选获得基因敲除突变株后，又构建了相应的回补菌株，并通过生物化学手段对野生型、突变株及回补株的相关毒力因子进行了测定（数据待发表），在进一步的研究工作中，将对菌株脂肪酸组成进行测定，寻找脂肪酸合成代谢与病原菌致病性间的相关性。

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（责任编辑：郑京津）

收稿日期：2020-07-22

基金项目：国家自然科学基金项目“核桃细菌性黑斑病菌环二鸟苷酸降解酶在DSF信号传导中的功能研究”（31700567）。

作者简介：陈雯雯（1996～），女，硕士研究生，主要从事生物技术研究。

李峰为通讯作者。