ATP参与缺氮诱导水稻主根伸长的研究分析

夏子怡，梁晶晶，徐晓蕊，秦 诚

(杭州师范大学生命与环境科学学院植物RNA信号传导中心，浙江 杭州 311121)

线粒体是真核生物细胞中的“能量工厂”，主要合成腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，用于真核生物的细胞生长和生命维持[1].植物线粒体中含有320多种蛋白质，大多数蛋白质由细胞核基因组编码，并在细胞质中合成和修饰后转运到线粒体[2].然而，线粒体也有自己的基因组并可以合成蛋白质，这些蛋白质在维持线粒体的结构和功能方面起着重要的作用[3].

在蛋白质合成过程中，有20个氨基酰化的转移RNA(aminoacylated transfer-RNA，aa-tRNA)参与蛋白质合成.大多数aa-tRNA是由aa-tRNA合成酶以直接途径形成的，该酶将每个tRNA和其关联的氨基酸酰化.但是，有4个aa-tRNA可以通过间接途径形成，其中之一是线粒体Glutamyl-tRNAGln(Gln-tRNAGln)[4].在间接途径中，需要tRNA依赖性酰胺转移酶(tRNA-dependent amidotransferase，AdT)将错误酰化的Glu-tRNAGln转化为Gln-tRNAGln.

作为tRNA依赖性酰胺转移酶(AdT)的一个亚基，GatB(Glutamyl-tRNAGlnamidotransferase B)位于线粒体并参与Gln-tRNAGln的合成，进而影响线粒体中的蛋白质翻译，并参与线粒体的结构功能.水稻OsGatB(LOC_Os11g34210)编码水稻线粒体AdT亚基GatB的基因，主要在水稻根中表达.本课题组在前期的研究[5]中，通过甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate，EMS)诱变获得了一个水稻Osgatb突变体，该突变体主要表现为主根变短.进一步研究发现，Osgatb突变体根细胞中的线粒体结构和功能受损，尤其是细胞中ATP含量下降，从而影响主根的生长，造成短根.但是Osgatb突变体中地上部长度和不定根数与野生型相比没有明显差异.

氮素是植物生长发育所需的一种极为重要且需求量最大的营养元素，它不仅是植物结构的组成元素，也是植物中代谢物质酶的主要成分之一，对植物的许多生理活动，如水分吸收、光合作用、组织生长等都起到非常重要的作用.植物吸收氮素有很多途径，但最主要的途径是通过根吸收土壤中的铵盐和硝酸盐.由于外部环境、氮的有效性以及植物自身碳氮平衡状态的不同，不同的植物对铵盐和硝酸盐吸收有所偏好，但大部分植物在一定比例的铵盐和硝酸盐的条件下生长最好.而当外界环境中氮素缺乏时，植物为了吸收足够的营养会诱导根系伸长[6].

虽然关于缺氮诱导植物主根伸长的研究有很多，但其作用机制尚不完全清楚.本研究发现，短根突变体Osgatb和野生型(wide-type，WT)相反，缺氮处理后主根变短，但地上部长度没有明显差异.进一步研究发现，缺氮后野生型和Osgatb突变体根中ATP含量均下降，表明ATP可能参与缺氮诱导植物根伸长.这一结果为揭示缺氮诱导水稻根长的机制提供新的研究方向，为指导育种实践奠定重要的理论基础.

1 材料与方法

1.1 植物材料

本研究使用的水稻材料为石狩白毛(SSBM)和短根突变体Osgatb，其中Osgatb由水稻品种石狩白毛经EMS诱变的群体中分离而得.

1.2 实验方法

1.2.1 生长条件

种子浸种置于30 ℃恒温箱中，3～4 d后将发芽的水稻种子播种于人工气候室中.人工气候室条件为：昼/夜温度为30/22 ℃，相对湿度为60%～70%，光照/黑暗时间为12 h/12 h，光照强度约为200 μmol·m-2·s-1.

本实验采用水培培养系统，营养液配方如Yoshida等[7]所述，并略加修改，配制的两种营养液分别为正常营养液(氮浓度为2.28 mol/L)和缺氮培养液(氮浓度为0 mol/L).

1.2.2 缺氮处理

参考前人的研究[8-9]，缺氮处理方法如下：野生型和突变体Osgatb的水稻种子先进行消毒，再挑选大小一致的种子用去离子水在30 ℃恒温箱中催芽，3～4 d后将发芽的水稻种子各均分成两组，分别转入正常营养条件和缺氮营养条件中生长.每天测定和调整营养液的pH，使其维持在5.5左右，培养期间每周换一次培养液.

1.2.3 根系长度测定

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当水稻生长到第10天和第30天时，分别测量各株地上部长度和地下部的根长.每种样品分别取10株苗进行测量.

1.2.4 ATP水平测定

水稻根系用蒸馏水洗净，吸水纸吸干水分，称量得到每株的根鲜质量.将根样品研磨后与三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)混合，使用生物发光测定试剂盒(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)测定样品中的ATP含量.

1.2.5 统计分析

每个实验至少进行3次生物学重复.各数据的处理与作图采用Microsoft Excel和SigmaPlot等软件.数据差异采用Microsoft Excel中的T-test检测，p<0.05时表示差异显著.

2 结果与分析

2.1 野生型和Osgatb突变体缺氮处理

A：缺氮处理10 d后的野生型和Osgatb突变体表型；B：缺氮处理10 d后主根长度；C：缺氮处理10 d后地上部长度.误差线表示标准偏差，星号表示显著差异(p<0.05)，ns表示无统计学意义.

当缺氮处理30 d后，野生型水稻在缺氮营养条件下的主根长是正常营养条件下主根长的92%，而Osgatb突变体在缺氮营养条件下的根长是正常营养条件下根长的70%左右(图2A、2B)，且地上部长度也都有明显的下降(图2C).

A：缺氮处理30 d后的野生型和Osgatb突变体表型；B：缺氮处理30 d后主根长度；C：缺氮处理30 d后地上部长度.误差线表示标准偏差，星号表示显著差异(p<0.05).

2.2 缺氮影响水稻根中ATP的合成

OsGatB编码线粒体AdT亚基GatB基因，该亚基参与Gln-tRNAGln的合成，从而影响线粒体中的蛋白质翻译.Osgatb突变体中根尖细胞线粒体结构和功能受损，影响根中ATP的合成[5].因此我们随后对正常营养条件下和缺氮营养条件下的野生型和Osgatb突变体的ATP含量进行测定.

结果显示，在正常营养条件下，Osgatb突变体的地下部ATP含量低于野生型(图3A).进一步研究发现，在缺氮处理后，野生型和Osgatb突变体地下部ATP含量均下降，其中野生型地下部ATP含量较正常营养条件下减少40%左右，而Osgatb突变体地下部ATP含量较正常营养条件下减少47%左右(图3A).但不管在正常营养条件还是缺氮营养条件下，野生型和Osgatb突变体的地上部ATP含量均无明显差异(图3B).

A：野生型和Osgatb突变体的地下部ATP含量；B：地上部ATP含量.误差线表示标准偏差，星号表示显著差异(p<0.05).

3 讨论

Osgatb是从水稻EMS诱变群体中分离得到的短根突变体，其突变基因被鉴定为OsGatB，该基因编码Gln-tRNAGln酰胺转移酶B亚基蛋白[10].Gln-tRNAGln是合成蛋白质所必需的，而Osgatb突变体植株中OsGatB的突变可能会影响根尖线粒体中蛋白质的合成.线粒体自身基因组编码线粒体蛋白质，这些线粒体蛋白质在维持线粒体结构和功能方面发挥关键作用.线粒体作为真核细胞的“动力工厂”，产生的ATP占细胞ATP总含量的90%以上，在细胞分裂过程中起到至关重要的作用.研究表明，OsGatB定位于线粒体，主要在根尖等分裂旺盛的部位中表达.根尖细胞的分裂与生长需要大量ATP，但在Osgatb突变体的主根中，线粒体结构和功能受损，ATP的合成量大大降低.能量缺乏使得根尖细胞分裂速率降低，从而出现短根表型[5].

氮素作为植物生长过程中必需的大量元素，对植物的各项生理活动和能量代谢起到重要作用.植物需要的氮素营养主要来源于土壤中的硝酸盐和铵盐，根系的吸收对氮素供应有适应性反应[11].大量研究显示，植物在缺氮条件下，会通过诱导根系的伸长来吸收氮源以满足基本生长需要[12].本研究结果与此一致，缺氮10 d的野生型水稻主根根长大于正常营养条件下的主根根长(图1)，但缺氮30 d的野生型水稻根长短于正常营养条件下的根长(图2).由此可见缺氮诱导野生型水稻主根伸长仅出现在诱导早期，随着胁迫时间的延长，长期的缺氮环境可能影响植物体内部分酶活性，如水稻在长期缺乏氮素的环境下，硝酸还原酶、谷氨酸合成酶活性会显著下降，从而抑制水稻主根生长[13].与野生型水稻不同，早期缺氮处理诱导水稻根伸长的现象在突变体Osgatb中并没有出现，10 d缺氮处理后突变体的根反而更短(图1).

检测野生型WT和突变体Osgatb水稻根中的ATP含量后发现，在正常营养条件下，Osgatb突变体的地下部ATP含量低于野生型(图3A)，这与之前的研究结果[5]一致.但是当缺氮处理后，与在正常营养条件下生长的植株相比，野生型根中ATP含量下降了40%，而突变体Osgatb根中ATP含量下降了47%(图3A).在外部环境氮缺乏条件下，植物为获取足够的氮素营养而刺激根伸长.根的伸长需要根尖细胞不断地进行分裂，这个过程需要大量的能量输出，即ATP的大量消耗[14].当外界环境的氮素营养不足时，由于野生型水稻的根尖细胞中线粒体完整，ATP合成能力正常，根尖细胞中ATP储备充足，满足根细胞短期内快速分裂的需求，细胞中的ATP含量也可以及时得到补充，所以虽然ATP含量较正常生长条件下低，但还能进一步消耗ATP用于满足植物主根生长的需要，短期缺氮能诱导水稻主根生长.而在突变体Osgatb中，线粒体受损，ATP合成受阻，根尖中的ATP含量无法满足植物主根快速伸长的需要，缺氮反而使得ATP含量更加降低，因此突变体Osgatb中主根更短，减少因主根生长而消耗ATP，最终导致缺氮后野生型主根诱导伸长，而突变体Osgatb主根反而更短.

本研究表明，根细胞中的ATP水平在缺氮诱导植物根伸长中发挥着重要作用，这为揭示缺氮诱导水稻根伸长的机制提供了新的研究方向，为后期进一步研究植物适应缺氮的机制奠定了基础.