苓桂术甘汤加味联合卡托普利对慢性心力衰竭大鼠BNP、ET-1、Caspase-3水平影响的研究

张燕飞,张 博,陈苏宁

(中国医科大学附属盛京医院，辽宁 沈阳 110004)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是一种继发于左室功能障碍的临床疾病，目前全世界有3700多万心力衰竭患者,且逐年增多[1]，并对卫生服务产生巨大需求[2]。CHF临床表现非常广泛，如呼吸困难、乏力和体液潴留等，甚至危及生命。中医无慢性心力衰竭之名，可归属“心悸”“胸痹”等范畴，基本病机是心气不足，推动血液能力下降，气虚血瘀，久病渐致CHF，气虚血瘀型心衰在临床中较常见[3]。《素问·痹论》云：“心痹者，脉不通，烦则心下鼓，暴上气而喘”。西药治疗心衰有效，中药能改善症状，且不良反应小，中西医联合治疗能有效减轻患者的不适状态，提高生存期望值。

B型钠尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)在临床中能准确地判断心衰严重程度,具有较高的临床诊断价值[4]。内皮素-1(Endothelin-1，ET-1)由内皮细胞及多种不同类型的细胞合成,对心脏损伤有较高的诊断价值。实验中心力衰竭动物和心力衰竭患者血浆ET-1水平升高,与血流动力学和症状的严重程度呈正相关[5]。有研究表明,血浆ET-1水平与心衰患者的病死率有关[6]。Savoj等[7]认为ET-1可能是HF的重要预后指标,ET-1水平升高与心衰加重、右心室功能下降、肺动脉压升高、左房容积指数升高有关[8]。ET-1被认为是心力衰竭的预测因子和预后指标[9]。在161例临床研究中,心衰患者血清中BNP和ET-1均高表达,高血压、低钠血症、高BNP、高ET-1是心血管不良事件的独立危险因素,血清BNP、ET-1与心力衰竭患者心泵功能及心室重构密切相关,可作为评价预后的重要参考指标[10]。在心动过速诱发心力衰竭犬模型细胞凋亡的实验中,心衰时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine aspartate specific protease 3,Caspase-3)基因表达增加[11]。

中医药治疗CHF在症状改善、整体康复医疗、提高生活质量等方面具有一定优势。吾师依据多年临床经验以苓桂术甘汤为基础增加黄芪、丹参、赤芍三味药，此方具有益气活血、温阳利水的功效。本实验通过观察比较不同干预条件下大鼠血清BNP、ET-1、Caspase-3水平的变化，研究苓桂术甘汤加味联合卡托普利对心衰大鼠的作用和疗效。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性SD大鼠60只，8周龄，体重180～220 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证号[SYXK(辽)2017-0004]。本课题符合实验动物伦理学标准，动物伦理编号2019PS430K。大鼠饲养于中国医科大学附属盛京医院本溪研发中心SPF级动物房，恒温恒湿、采光明暗交替12 h、无菌饲料专人喂养，适应性喂养1周后开始实验。

1.1.2 主要试剂：盐酸异丙肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司，批号41190402)；卡托普利片(上海旭东海普药业有限公司，批号PA180308)；ET-1、BNP、Caspase-3双抗夹心酶联反应试剂盒(上海酶联生物有限公司，批号分别为20190626、20190718、20191022)；中性树脂(中国上海标本模型厂，批号20170715)；0.9%氯化钠注射液(华仁药业股份有限公司，批号 Q1906060)。

1.1.3 主要仪器：显微镜 (型号 E800)；图像采集软件(版本NIS-Elements F3.0)；PowerLab生理记录仪(型号Power Lab PL3508)；电子天平(常熟市双杰测试仪器厂，JJ323BC型)；彩色超声诊断系统(Philips Ultrasound公司，型号iE33)；多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司，型号NS20150619016)。

1.2 实验方法

1.2.1 苓桂术甘汤加味：茯苓、黄芪各20 g，桂枝、炙甘草各10 g，白术、丹参、赤芍各15 g。药品由中国医科大学附属盛京医院免煎药房提供。

1.2.2 建模、分组及给药：SPF雄性SD大鼠50只，随机选取10只为正常组，剩余40只建立心衰大鼠模型，腹腔注射异丙肾上腺素，剂量为5 mg/(kg·d)，1次/d，连续7 d复制心衰模型[12]，1周后将造模成功大鼠按随机数字表法分为心衰组10只、中药组10只、西药组10只、联合组10只。根据《药理实验方法学》给药剂量换算，大鼠给予剂量是人的6.3倍，西药组给予2.5 mg/(kg·d)的卡托普利灌胃，中药组给予3 g/(kg·d)的苓桂术甘汤加味灌胃，联合组予等剂量卡托普利联合等剂量苓桂术甘汤加味灌胃，心衰组和正常组给予等体积生理盐水，以上各组均1次/d，连续4周灌胃。

1.2.3 心功能检测：灌胃4周后，正常组与心衰组分别随机抽取5只大鼠，多普勒彩色超声检测左室射血分数(Left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.2.4 病理形态学观察：取大鼠左心室置于4%多聚甲醛溶液,4 ℃冰箱固定48 h,常规切片后将玻片放置于60 ℃烘烤箱中12 h,HE染色后用中性树胶封片,晾干。通过电子显微镜拍照,采集分析组织相关部位。

1.2.5 BNP、ET-1、Caspase-3的水平检测：灌胃4周后，10%水合氯醛麻醉大鼠，用5 ml注射器从腹主动脉采血。将血液置于4 ml的EP管中，室温自然凝固2 h。低温高速离心20 min，转速为3000 r/min，取上清液，采用ELISA法进行测定。

1.2.6 心脏质量指数(Heart mass index,HMI)检测：取心脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，用电子秤称重，计算心脏质量指数。计算公式：HMI=心脏重量/总体重×100%。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠外观状态观察 正常组大鼠一切如常，其余四组大鼠出现脱毛、呼吸喘促、脚部水肿、行动迟缓以及死亡。最终实验处理前，心衰组死亡3只，西药组死亡2只，中药组死亡2只，联合组无死亡。

2.2 各组大鼠心功能比较

2.2.1 正常组与心衰组心电图比较：造模1周后，从正常组和心衰组中随机抽取大鼠记录其心电图，观察心率变化，心衰组R-R间期缩短，心率代偿性增快(图1)。

图1 正常组与心衰组大鼠心电图比较

2.2.2 各组大鼠LVEF、HMI比较：治疗4周后,各给药组大鼠的LVEF、HMI水平明显优于心衰组,组间差异具有统计学意义(均P<0.05)，而给药组之间两两比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠LVEF、HMI水平比较

2.2.3 各组大鼠心肌细胞组织病理学：光镜下观察各组大鼠心肌细胞病理学情况(图2)。正常组心肌纤维结构正常；心衰组心肌细胞肥大、肌纤维增厚、细胞核增大、排列紊乱，部分心肌细胞坏死、空泡变性，伴有不同程度的炎症细胞浸润。中药组、西药组、联合组大鼠心肌纤维增厚、排列稍紊乱，伴轻度炎症细胞浸润。

图2 各组大鼠心肌细胞组织病理学比较(HE染色，×200)

2.2.4 各组大鼠血清BNP、ET-1、Caspase-3水平比较：三组给药大鼠治疗后BNP、ET-1和Caspase-3水平均有所下降,各给药组与心衰组比较，差异具有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清BNP、ET-1、Caspase-3水平比较

3 讨 论

CHF是一种综合征，不仅患病率高，而且预后差，已成为老年人死亡的主要原因之一。在我国古代医学书籍中，心气虚是心衰最基本的病机[13]。中药在稳定病情、改善心脏功能、提高生活质量等方面具有明显的优势，临床多采取益气活血，温阳利水消肿的治疗原则，疗效较好[14-15]。苓桂术甘汤加味由吾师多年经验而来，本研究旨在验证苓桂术甘汤加味对心衰大鼠BNP、ET-1、Caspase-3指标的影响，为临床用药提供依据。

ET-1前体分子在合成ET-1过程中产生的血浆ET-1及其相关肽的循环水平作为心血管事件的潜在危险标志物已被广泛研究。ET-1在调节血管张力中起关键作用，并可诱导心肌细胞肥大、成纤维细胞增殖和纤维化。ET-1的作用是通过细胞表面受体的参与，导致细胞内通路激活，从而使血管收缩，平滑肌细胞增殖,与心衰严重程度呈正相关[16]。冠心病患者ET-1水平高于健康人，ET-1水平与疾病严重程度及心脏功能密切相关[17]。Bossard等[18]研究发现ET-1的表达水平不仅与CHF有关，还与急性心力衰竭、冠心病等心血管疾病有关。Horckmans等[19]在大鼠模型上进行了实验，并认为ET-1水平降低与微血管通透性降低、中性粒细胞浸润和内皮细胞黏附分子表达减少有关。ET-1与衰老、血压、肺功能和慢性肾脏疾病的关系，以及ET-1水平与心脏重构(包括左心房直径增加和左心室质量增加)相关的证据已被描述。ET-1被认为是心力衰竭的预测因子和预后指标。Caspase-3是细胞凋亡的重要基因之一。有研究显示，TAC小鼠心肌中的Catenin表达水平显著升高，相应的，促凋亡蛋白即Caspase-3和Bax的表达水平显著升高，Caspase和Bcl-2家族蛋白是凋亡通路的关键因素，Caspase-3是参与细胞凋亡的主要Caspases之一，Caspase-3在心肌细胞凋亡中起重要作用[20]。

通过本实验可以得出，苓桂术甘汤加味联合卡托普利可以明显逆转慢性心力衰竭大鼠心脏充血、水肿等肉眼改变，减少心肌病理结构的异常改变，降低血清BNP、ET-1、Caspase-3水平，提高LVEF水平，改善心衰大鼠的生活状态，进而为临床用药提供科学依据。