天然环烯醚萜类化合物提取及纯化技术研究新进展

谢 玲，张学俊，陶 菡，贺扬洁，张灵丽

(1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室, 贵州 贵阳 550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025)

0 引言

我国药用植物种类繁多，种植面积和分布较广，是国家独有的种质资源。一方面，药用植物的经济价值和生态效益在农业发展中占有举足轻重的地位，另一方面，充分利用药用植物资源进行产品开发，是打开我国农业发展新局面的重要战略举措之一。目前，利用药用植物活性成分开发的产品，在国际市场上具有较大的商业潜力和经济效益。将农业与医药、食品、化妆品等行业有效结合，不仅有利于新产品开发，扩大资源利用，打开市场新格局，还可以实现“药用农业”产业转型升级。

药用植物资源的利用是基于其天然产物的活性功能价值。环烯醚萜(Iridoids)是一类重要的次生代谢产物，具有广泛的生物活性，是用于预防骨质疏松、“三高”、癌症、帕金森病(PD)等疾病治疗发挥药效的主要基础物质。目前主要应用于医药行业，基于它的抗炎、抗病毒、抗氧化等活性功能，有望在食品、保健品、果蔬保鲜和化妆品等领域应用。该类化合物在夹竹桃科、玄参科、茜草科、唇形科、马鞭草科、龙胆科和木犀科等67种双子叶植物中普遍存在[1-2]。在进行样品分析检测和产品开发前，往往需要采取必要的手段进行提取和纯化以消除杂质干扰。本文对环烯醚萜类化合物的生物酶法(enzyme-assisted extraction，EAE)、表面活性剂辅助提取(surfactant assisted extraction，SAE)、离子液体辅助提取(ionic liquids assisted extraction，ILs)、超声波辅助提取(ultra-sound-assisted extraction，UAE)、微波辅助提取(microwave-assisted extraction，MAE)、加速溶剂萃取(accelerated solvent extraction，ASE)、加压液体萃取(pressurized liquid extraction，PLE)、超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，SFE)、逆流分离技术(countercurrent separation，CCS)、大孔吸附树脂法和膜分离法等方法进行系统阐述，以期为这类物质的工业化提取、纯化供以参考，使得相关药用植物的开发利用促进“药用农业”可持续健康发展，提高农民收入。

1 提取方法

1.1 生物酶提取

郑阳[3]用纤维素酶从杜仲叶中提取杜仲醇，在料液比1∶25 g/mL、酶解温度30 ℃、pH值7.0、酶用量1.0%、酶解4 h和提取1次时，杜仲总醇提取率0.235 7%。陈玉甫等[4]使用蛋白酶、果胶酶和纤维素酶分步连续酶解提取杜仲树皮中的桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸和绿原酸4种活性成分，所得桃叶珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸3种环烯醚萜的含量分别为22.42、77.89和110.05 μg/g，提取率高于乙醇提取法和水提法。CHEN Gang等[5]加入离子液体辅助酶解从杜仲中提取京尼平，首先将纤维素酶加入到离子液体溶液中，调节酸碱度，称取杜仲皮粉末置于酶-离子液体溶液中搅拌混匀，在液固比19.81 mL/g、纤维素酶浓度5.15 mg/mL、pH值5.0时，处理样品140 min，京尼平含量0.64 mg/g。

单一酶解提取时，水解速度慢，加入某些特定的表面活性剂、离子液体可以增强酶活性。

1.2 表面活性剂辅助提取

GONDA S等[6]用毛细管电泳-胶束电动色谱法从不同提取物中提取桃叶珊瑚苷、梓醇、苯乙醇苷、毛蕊花糖苷和车前草苷，研究了不同电解质和表面活性剂类型对提取效果的影响。最终选择15 mM四硼酸钠、20 mM TAPS和250 mM DOC作为提取溶剂时，具有良好的稳定性和准确性，取得了较好的分离效果。LI Fajie等[7]用非离子表面活性剂辅助红外光谱提取胡黄连苷I和胡黄连苷II，红外功率200 W，10%非离子表面活性剂聚乙二醇单烷基醚(GX-080)，料液比1∶150，红外辅助提取4 min，胡黄连苷I和胡黄连苷II的含量分别为6.898 3和39.298 2 mg/g。GUO J等[8]用SDS辅助微波提取杜仲皮中总环烯醚萜，在SDS浓度2 mg/mL、料液比1∶50、微波功率1 100 W、提取6 min时，总环烯醚萜提取率高达95%～105%。

表面活性剂的使用可有效替代有机溶剂，一方面缓解了环境污染严重的问题，另一方面可以减小生产成本，提高提取效率。

1.3 离子液体辅助提取

CAO Xiaoji等[9]用离子液体辅助超声提取法与超高效液相色谱、电喷雾电离四极杆飞行时间串联质谱结合，同时筛选胡黄连中的环烯醚萜苷、苯乙醇苷和葫芦素苷，在最佳工艺为超声波功率500 W、离子液体[BMIM][BF4]、料液比1∶500 g/mL和超声30 min时，胡黄连苷I、胡黄连苷II、6-O-E-阿魏酸梓醇的提取率分别为2.84%、3.57%和2.20%，提取率比热回流提取法高2～3倍。DU Kunze等[10]采用离子液体涡旋强化基质固相分散法，通过对离子液体类型、吸附剂类型、样品与吸附剂比例、离子液体浓度和体积、研磨时间和涡流时间等参数进行优化，最后选用SiO2作为分散吸附剂，以浓度为6 mL 175 mM的[Domim]HSO4作为洗脱剂，山茱萸粉末中莫诺苷、狼芽菜苷、马钱苷和山茱萸苷的含量分别为0.59%～0.93%、0.048%～0.056%、0.036%～0.470%和0.65%～0.74%，山茱萸粗品中的含量分别为1.57%～1.61%、0.061%～0.078%、0.54%～0.64%和0.16%～0.19%。

利用离子液体水溶液的两亲性，使其形成两相体系可用作多功能分离板，作用于植物基质时与目标分析物形成离子-偶极、π-π共轭等相互作用，可以促进目标组分从基质中剥离[11]。

1.4 超声波辅助提取

超声波作用于水溶液中产生空化作用，撕裂水分子团形成大量空腔微气泡，在植物组织缝隙中形成超声微射流，使植物组织表面剥落和破裂，进一步扩大溶剂与基质的接触表面积，使溶剂渗透到植物细胞中加快分析物溶出[12]。

1.5 微波辅助提取

CHENG Zhenyu等[16]用微波辅助提取法从龙胆中提取龙胆苦苷，提取溶剂为21.71% K2HPO4和40.72%乙醇，温度80 ℃、微波功率806 W、料液比1∶11 g/mL和微波处理31 s时，龙胆苦苷含量65.32mg/g。WAKTE P等[17]用该方法从胡黄连中提取胡黄连苷I、胡黄连苷II，以水为提取溶剂，料液比1∶9 g/mL、温度60 ℃和提取60 s时，其含量分别为41.23和6.12 mg/g。傅亚等[18]以玄参为原料，用微波辅助提取哈巴苷和哈巴俄苷，以水为提取剂，料液比1∶20 g/mL、微波功率600 W、温度50 ℃和提取30 min时，总提取率1.117 2 %。WANG Xin等[19]用该方法从生地黄中提取益母草苷、梓醇，在最佳工艺参数为甲醇体积分数60%、温度60 ℃、料液比1∶50 g/mL和提取10 min时，益母草苷、梓醇的含量分别为0.86和6.87 mg/g。

MAE不仅可以最大程度地提取目标化合物，还可以在短时间内快速均匀加热，以最大程度地减少目标化合物在高温和空气中长时间暴露导致的降解[20]。

1.6 加速溶剂萃取

朱君燕等[21]采用加压溶剂萃取法(PSE)提取山茱萸中环烯醚萜苷，在90%乙醇、压力9 000 kPa、温度60 ℃和保压20 min时，总环烯醚萜苷提取率40.46 mg/g，高于超声提取(39.95 mg/g)和回流提取(37.83 mg/g)。PSE法与超声波法的提取率虽然相差不大，但PSE通过试验优化及与其他下游技术联用可以有效增加目标分析物提取量，且更易实现自动化；与索式提取相比，虽然两者提取率相差小，但索式提取法用时是PSE法的8～12倍。李婷等[22]采用在线加压溶剂提取-超高效液相色谱-离子肼-飞行时间质谱(Online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS)联用技术实现了草苁蓉化学成分的快速分析，样品提取池由空预柱芯和正相硅胶组成，柱芯用滤膜密封后将其装入预柱套内，通过0.1%甲酸水溶液自动触发提取，提取温度70℃、提取压力约25 MPa、提取3 min时，鉴定了10个苯乙醇苷类、14个环烯醚萜苷类及21个苯丙醇苷类化合物。与UAE相比，该方法提取的样品色谱峰响应值整体高于UAE。

PSE与常温常压下的溶剂提取技术相比，可以大大地提高提取效率和性能，主要在于高温高压下可以获得良好的溶解度和传质效果。

1.7 超临界流体萃取

PATIL A A等[23]用超临界CO2萃取法从胡黄连中提取胡黄连苷I和胡黄连苷II，萃取压力30 MPa、温度40 ℃和助溶剂浓度10%时，胡黄连苷I和胡黄连苷II含量分别为32.50±1.13和9.72±0.38 mg/g。LI Hui等[24]以杜仲种子为原料，比较超临界CO2萃取和索式提取法对桃叶珊瑚苷提取效果的影响，萃取助溶剂为水-乙醇混合物(1∶3，v/v)，料液比1∶6 g/mL、萃取压力26 MPa、提取温度55℃、分离温度30 ℃和CO2流速20 L/h时，提取100 g物料用时2 h，桃叶珊瑚苷提取率1.921%，而索式提取法提取10 g物料用时3 h，桃叶珊瑚苷提取率1.606%，超临界CO2萃取法效果更好，目标化合物收率和能耗均低于索式提取法。

该方法集萃取和富集于一体，超临界流体先选择性地将极性、分子量和沸点不同的组分萃取后，通过改变压力和温度使分析物析出，从而实现分离纯化。

2 分离纯化方法

2.1 逆流分离技术

WANG Yarong等[25]用逆流分离法从栀子中提取环烯醚萜苷和藏红花酸衍生物，先将样品用HPD-100柱层析分离后，使用不同的溶剂体系进行分离纯化，选择正丁醇-乙醇-水(10∶1∶10，v/v)从馏分A中纯化栀子苷、6β-羟基-京尼平苷和京尼平苷酸；乙酸乙酯-正丁醇-水(2∶1.5∶3，v/v)体系用于从馏分B中分离京尼平苷；己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶2∶1∶5，v/v)用于从馏分C中纯化藏红花苷1、藏红花苷2、藏红花苷3和藏红花苷4，流速8 mL/min，转速600 r/min，其纯度分别为91.7%、93.4%、92.5%、98.2%、94.1%、96.3%、94.1%和98.9%。根据目标化合物的结构和基质的复杂性，向正丁醇-水体系中加入非极性或极性溶剂改变溶剂体系的极性范围。CHEN Bao等[26]以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶1∶3，v/v)作为溶剂体系，在分离速度800 r/min和流速5 mL/min的条件下，从龙胆草根提取物中纯化三氟氯苷，其纯度98.9%。为了优化离子化合物的分配或降低溶剂系统的乳化作用，尤其是样品溶液中含有酸性杂质时，可以加入少量有机酸，以缩短双相溶剂系统沉降时间，提高固定相保留率，改善分离度。

在任何逆流分离技术中，最关键是溶剂体系的选择。分配系数值(K)较小时峰分离度差，而K值较大时会导致过度的谱带展宽。因此，选择合适的溶剂体系可以提供适宜K值，使其达到“最佳点”以获得最佳的分离效果。

2.2 大孔吸附树脂法

张瑜等[27]考察了D-101、H-103、NKA-II、ME-1、ME-2、XDA-1、YWD03D、YWD07D和YWD09D共9种对总环烯醚萜苷比吸附量较大的树脂对金银花环烯醚萜苷类成分的分离纯化效果，发现H-103型大孔树脂的吸附和洗脱能力较好，用30%乙醇以2.0 BV/h的流速洗脱后，总环烯醚萜苷的洗脱率达90.0%。WANG Lu等[28]用AB-8大孔吸附树脂法和高效液相色谱-电喷雾串联质谱联用技术与离子迁移谱技术结合，从栀子提取物中分离得到了环烯醚萜类苷等71种化合物。蒋丽娟等[29]用SP825大孔吸附树脂结合硅胶柱色谱法分离纯化玄参哈巴苷，其纯度达98%以上。沈燚等[30]筛查了AB-8、ADS-17、D101、HPD400、HPD600、HP20、S-8、SP850、XDA-1和XDA-16等极性和非极性树脂对巴戟天环烯醚萜苷类成分(MOIG)的吸附、解吸附作用，结果表明，XDA-1型大孔树脂效果最佳，其含量达54%以上。苏娅等[31]以30%乙醇作为洗脱剂，用D101型大孔树脂纯化肉苁蓉毛蕊花糖苷，其含量为25.1%。

该方法在天然产物分离纯化中较为常用，经大孔树脂处理后不仅可以通过减少提取物中的杂质来提高制剂的内在质量，还可以降低产品的吸湿性，增强提取液稳定性，此外，还能去除重金属、农药残留等有害成分，从而提高制剂的安全性。

2.3 膜分离法

膜分离中常用的膜分离技术包括反渗透(RO)、超滤(UF)、电渗析(ED)、纳滤(NF)、膜蒸馏(MD)和渗透汽化(PV)[32]。郭立玮等[33]用超滤膜法考察生物碱和环烯醚萜类物质的透过率及其定量构效关系，结果表明，栀子苷等4种环烯醚萜类化合物的透过率<50%，可能是因为料液组分之间存在透过竞争。在膜分离过程中，栀子苷这类小分子物质易被大分子包裹而被截留。徐益清等[34]以复方板蓝根水提液为研究对象，选用200和50 nm孔径陶瓷膜分离哈巴俄苷、甘草苷等6种有效成分，平均迁移率分别为85%、83%。宋逍等[35]用膜分离法纯化穿山龙薯蓣皂苷，最佳工艺参数为料液浓度2 g/L、过膜温度30 ℃和过膜压力0.8 MPa，其平均转移率44.88%。

尽管膜分离法具有诸多优点，但仍存在以下问题。膜污染导致通量下降，膜的清洗和再生是应用过程的关键。膜材质对提取液中某些成分的吸附，导致转移率下降。由于提取液组分体系复杂，淀粉、蛋白质和果胶等高分子物质与小分子有效组分以胶体或水合物的状态存在，甚至被大分子物质包裹，在膜分离过程中产生空间位阻，导致目标化合物透过率低。

3 各方法优缺点及其他方法

对以上各方法的优缺点进行归纳总结，以期为环烯醚萜类化合物的提取及纯化方法选择提供精准参考，结果如表1所示。

表1 各方法优缺点比较Tab.1 Comparison of advantages and disadvantages of these methods

除以上提取及纯化方法外，如分子印迹固相萃取技术(MISPE)、硅胶柱色谱法和半制备色谱技术等方法也可用于分离环烯醚萜类化合物。CHEN Lizong等[36]采用分子印迹固相萃取技术分离纯化栀子苷、京尼平苷酸等5种环烯醚萜苷(IGs)，以京尼平苷为模板，α-1-烯丙基-2-N-乙酰氨基葡萄糖(NAP)作为新型水溶性功能单体，制备了对环烯醚萜苷具有特异分子识别能力的亲水性分子印迹聚合物。萃取分离前将5.0 g MIP装入固相萃取柱中，栀子提取物以20.0 mL/min的流速加载到MISPE上，乙酸乙酯/乙醚(3.0 mL，pH值8.5)以18.0 mL/min的流速洗脱，采用HPLC-DAD进行检测分析，所得5种环烯醚萜类化合物(IGs)的纯度均>98%。该方法分子印迹聚合物的制备，以及确定最佳比例的模板/功能单体、交联剂/功能单体的过程复杂且耗时。SAIDI I等[37]用硅胶柱色谱结合制备型HPLC从垂花琴木的花中分离得到了一种新的环烯醚萜苷(Spinomannoside)。

4 结束语

从环烯醚萜类化合物提取及纯化方法的发展进程上看，单元操作有时不能满足需求，需要采用多种方法联用技术。通过使用力、声、微波和电场等多能量场来提高传质速率的文献报道日渐增多，可以有效缩短样品制备的时间，如微波-热压场，超声强化微波辅助提取和ASE等。另一方面，通过除杂、分离、分级和富集一体化战略技术可以替代传统方法中的多步骤单元操作，更省时，更易实现自动化，且能有效避免热不稳定性组分的降解损失，如SFE、膜分离法。目前，很多提取方法仍然停留在实验室阶段，需要不断完善提取方案，朝着适应规模化生产的方向发展，以最大限度提高产品的附加值。