基于转录组学的敦煌颤震方保护PD阴虚动风证大鼠DA能神经元的机制研究

孙 雪 梁建庆,2* 何建成 马利芳

1.甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.敦煌医学与转化教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.上海中医药大学基础医学院，上海 201203

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是全球第二大神经退行性疾病，全世界现有约580万PD患者，中国患病人数约为260万，居世界第一位[1]。PD的主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺(dopamine，DA)能神经元变性缺失，导致纹状体内DA含量减少到80%以上，患者出现临床症状[2]。明确DA能神经元损伤的机制，对PD的防治具有重要意义。笔者利用Illumina HiSeq高通量测序平台技术，获得正常组、模型组、敦煌颤震方组大鼠右侧黑质及纹状体的转录组信息，对筛选得到的差异表达基因进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，旨在为深入探究DA能神经元的存活方式以及对敦煌颤震方的药理作用等分子应答机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及条件 健康雄性SPF级SD大鼠，体质量180～200g，鼠龄38～40周，18只，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，许可证号码：SCXK(甘)2015-0002。饲养期间保持自由饮水和进食，饲养环境温度为(24±1)℃，湿度为(55±5)%，实验前适应性喂养1周。

1.2 主要试剂和仪器 6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA, 批号：MKBP0832V)、阿扑吗啡(apomorphine，APO，批号：SLBF6369V)、抗坏血酸(批号：063K1082)：美国Sigma公司产品。戊巴比妥钠(批号：WS20130212)：上海中西药业股份有限公司产品；庆大霉素(批号: 20230675)：上海第一制药厂产品，0.3 g/支。

大鼠脑立体定位仪：RWD-68003型，深圳瑞沃德生命科技有限公司；高速冷冻离心机：Multifuge IS-R，德国THERMO公司；超声破碎仪：XL 2000，美国MISONIX公司；微量进样器：5 μL，上海第三分析仪器厂；漩涡混匀器：XW-80A，上海医科大学仪器厂；分析天平：910324，Sartorius anglytic；秒表：926266，上海秒表厂。

1.3 药物制备 敦煌颤震方组成：山茱萸20 g，牛膝20 g，黄芪20 g，桂枝12 g，桃仁12 g，枳壳10 g，茯苓10 g，槟榔10 g，白蒺藜10 g。按既定工艺煎煮成汤药，由甘肃中医药大学中药制药实验室提供。敦煌颤震方组的给药剂量按人体每日用量换算成大鼠灌胃剂量，溶解于0.9%氯化钠溶液，配制成相应灌胃浓度[3]。

1.4 模型制备、分组及给药 采用Ungerstedt等[4]建立并经过本课题组验证的二点法进行模型构建[5-8]。术前按常规进行行为测试，确认无异常旋转行为后，用3%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉。然后将大鼠固定于脑立体定位仪上，头部去毛，苯扎溴铵(商品名:新洁尔灭)常规消毒。无菌条件下，沿正中线切开大鼠颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟。以前囟为准，根据包新民等[6]著大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质二坐标:①前囟后5.2 mm，正中线右侧1.0 mm，硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm，正中线右侧2.5 mm，硬膜下8.5 mm。用颅骨钻于手术要求部位小心钻开颅骨，用5 μL微量进样器将6-OHDA(溶于含0.2%维生素C的生理盐水中，即秤量药品抗坏血酸0.001 g，溶于生理盐水0.5 mL中)注入右侧黑质部(以1.0 mm/min速度缓慢进针)，每孔3 μL，注射速度为1 μL/min，注射完毕后留针5 min，然后以1.0 mm/min速度缓慢退针。手术完成后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，肌肉注射庆大霉素7 d，待动物清醒后放回饲养笼中饲养。10 d后，以腹腔注射APO 0.5 mg/kg诱发大鼠向一側旋转，记录开始旋转至30 min内的旋转圈数，以旋转圈数平均7次/min者为合格的PD模型。

模型制备成功后，采用分层随机法将12只PD阴虚动风证模型大鼠分为2组：模型组，敦煌颤震方组(14 g/kg)，每组6只；另取6只大鼠不作造模处理设为正常组。敦煌颤震方组用0.9%氯化钠溶液溶解，每天灌胃1次；正常组和模型组以等体积0.9%氯化钠溶液(2 mL/只)灌胃，连续用药6周。处死大鼠，取右侧黑质及纹状体组织，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.5 实验指标测定

1.5.1 样品检测 Nanodrop检测右侧黑质及纹状体组织中RNA的纯度(OD260/280)、浓度、核酸吸收峰；Agilent 2100检测RNA的完整性，检测指标包括：RIN值、28S/18S、图谱基线有无上抬、5S峰。

1.5.2 文库构建 样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，加入Fragmentation Buffer将mRNA进行随机打断，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA(complementary DNA)链，然后加入缓冲液、dNTPs(Dideoxynucleotide)、RNase H(Ribonuclease H)和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA，纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后通过PCR(Polymerase Chain Reaction)富集得到cDNA文库。

1.5.3 文库质控 使用Qubit 2.0进行初步定量，使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后才可进行下一步实验。Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2 nM)，完成库检。

1.5.4 上机测序 库检合格后，不同文库按照目标下机数据量进行pooling，用IlluminaHi Seq平台进行测序。委托北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.6 生物信息学分析 将下机数据进行过滤得到Clean Data，与指定的参考基因组进行序列比对；根据基因在不同样品组中的表达量进行差异表达分析、差异表达基因KEGG注释及通路富集分析。

2 结果

2.1 各组比对结果作图 将各组大鼠比对到不同染色体上的Reads进行位置分布统计，绘制Mapped Reads在所选参考基因组上的覆盖深度分布图，便于后续分析。如图1所示。

图1 Mapped Reads在参考基因组上的位置及覆盖深度分布注：A.正常组(右侧黑质)；B.正常组(右侧纹状体)；C.模型组(右侧黑质)；D.模型组(右侧纹状体)；E.敦煌颤震方组(右侧黑质)；F.敦煌颤震方组(右侧纹状体)。横坐标为染色体位置；纵坐标为覆盖深度以2为底的对数值。蓝色为正链，绿色为负链。

2.2 差异基因表达筛选火山图 正常组和模型组(右侧黑质/右侧纹状体)之间有143/149个显著性差异表达基因，其中78/86个基因上调表达，65/63个基因下调表达；正常组和敦煌颤震方组(右侧黑质/右侧纹状体)之间有83/91个显著性差异表达基因，其中47/50个基因上调表达，36/41个基因下调表达；模型组和敦煌颤震方组(右侧黑质/右侧纹状体)之间有56/61个显著性差异表达基因，其中31/31个基因上调表达，25/30个基因下调表达。如图2所示。

图2 3组组间差异基因表达筛选火山图注：A.正常组VS模型组(右侧黑质)；B.正常组VS模型组(右侧纹状体)； C.正常组VS敦煌颤震方组(右侧黑质)；D.正常组VS敦煌颤震方组(右侧纹状体)；E.模型组VS敦煌颤震方组(右侧黑质)；F.模型组VS敦煌颤震方组(右侧纹状体)。差异表达火山图中的每一个点表示一个基因，横坐标表示某一个基因在两样品中表达量差异倍数的对数值；纵坐标表示基因表达量变化的统计学显著性的负对数值。图中绿色的点代表下调差异表达基因，红色的点代表上调差异表达基因，黑色的点代表非差异表达基因。

2.3 差异基因表达筛选MA图 通过MA图可以直观地查看两组样品之间差异基因表达水平的整体分布。具体结果见表1、图3。

图3 3组组间差异基因表达筛选MA图注：A.正常组VS模型组(右侧黑质)；B.正常组VS模型组(右侧纹状体)； C.正常组VS敦煌颤震方组(右侧黑质)；D.正常组VS敦煌颤震方组(右侧纹状体)；E.模型组VS敦煌颤震方组(右侧黑质)；F.模型组VS敦煌颤震方组(右侧纹状体)。差异表达基因MA图中每一个点代表一个基因。横坐标为A值，纵坐标为M值，用于衡量表达量差异的大小。图中绿色的点代表下调差异表达基因，红色的点代表上调差异表达基因，黑色的点代表非差异表达基因。

表1 差异表达基因数目统计表

2.4 差异表达基因KEGG注释 对差异表达基因KEGG的注释结果按照KEGG中通路类型进行分类，分类结果如图4所示。

图4 3组组间差异表达基因KEGG注释注：A.正常组VS模型组(右侧黑质)；B.正常组VS模型组(右侧纹状体)； C.正常组VS敦煌颤震方组(右侧黑质)；D.正常组VS敦煌颤震方组(右侧纹状体)；E.模型组VS敦煌颤震方组(右侧黑质)；F.模型组VS敦煌颤震方组(右侧纹状体)。纵坐标为KEGG代谢通路的名称，横坐标为注释到该通路下的基因个数及其个数占被注释上的基因总数的比例。

2.5 差异表达基因KEGG通路富集分析 通过KEGG富集分析得到：PI3K-Akt Signaling pathway(PI3K-Akt信号通路)、MAPK Signaling pathway(MAPK信号通路)、cAMP signaling pathway(cAMP信号通路) 、TNF signaling pathway(肿瘤坏死因子信号通路)、cGMP-PKG signaling pathway(cGMP-PKG信号通路)等通路, 这些均与PD相关；还发现Valine, leucine and isoleucine degradation(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解)、Protein digestion and absorption(蛋白质消化吸收)、Vitamin B6 metabolism(维生素B6代谢)等途径的差异显著,说明这些代谢途径极有可能与DA能神经元分化相关。

图5 3组组间差异表达基因KEGG通路富集分析注：A.正常组VS模型组(右侧黑质)；B.正常组VS模型组(右侧纹状体)； C.正常组VS敦煌颤震方组(右侧黑质)；D.正常组VS敦煌颤震方组(右侧纹状体)；E.模型组VS敦煌颤震方组(右侧黑质)；F.模型组VS敦煌颤震方组(右侧纹状体)。图中每一个圆表示一个KEGG通路，纵坐标表示通路名称。

3 讨论

课题组以中西医理论为基础，结合多年的临床经验，认为PD病在筋脉，与肝、脾、肾等脏关系密切。基本病机为肝风内动，筋脉失养。《素问·痿论》曰：“肝主身之筋膜。”《素问·六节脏象论》云：“肝者……其充在筋。”《素问·经脉别论》道：“食气入胃，散精于肝，淫气于筋。”《素问·上古天真论》认为：“七八，肝气衰，筋不能动。”肝为风木之脏，其气血亏虚，筋脉失养，则肝风内动，筋脉不能任持自主，随风而动，牵动肢体及头颈颤抖摇动。《素问·阴阳应象大论》岐伯曰：“人年四十而阴气自半也，起居衰矣。”肝肾乙癸同源，年高体衰，肾精渐亏，或劳欲过度，致肝肾阴虚，肾虚髓减，脑髓不充，风阳上扰，上盛下虚则高摇。肝木横克脾土，可致痰湿内生。日久可导致络脉瘀阻，出现肢体僵硬，动作迟滞乏力之象。故本病的病理性质为本虚标实证，本虚为肝肾亏损，脏腑功能失调；标实为风、痰、瘀互结，蕴塞脑窍。内风是本病病理演变过程中始终贯穿的因素之一，是发病的主要原因。故课题组提出“滋补肝肾、活血祛瘀、化痰消积”诸法合用是其治疗法则。据此立法组方，充分挖掘敦煌医学的文献资料，研制了治疗PD的中药复方—敦煌颤震方[9]。该方由山茱萸、牛膝、黄芪、桂枝、桃仁、枳壳、茯苓、槟榔、白蒺藜组成，方中山茱萸性微温味酸，归肝、肾经，可补益肝肾、补精助阳。《日华子本草》认为山茱萸善“暖腰膝，助水脏。”牛膝性平味苦酸，归肝、肾经，可补肝肾、强筋骨、活血祛瘀。共为君药；黄芪性微温味甘，归脾、肺经，可补气生血、活血壮筋骨。桂枝性热味辛甘，入心经，根据中医 “赤入心”的理论, 可助心阳、交心肾、暖腰膝、续筋骨、疏通血脉。二者配伍，可共奏活血祛瘀的作用。桃仁性平味苦，归心、肝、肺、大肠经，可活血祛瘀。共为臣药；枳壳性微寒味辛苦，归脾、胃、大肠经，可破气消积化痰。茯苓性平味甘淡，归心、脾、肾经，可利水渗湿、健脾祛痰。槟榔性温味辛苦，可行气消积利水、导滞化痰。共为佐药；白蒺藜性平味辛苦，归肝经，可平肝疏肝、祛风平颤，为使药。上述诸药合用，可滋补肝肾、活血祛瘀、化痰消积。

本研究构建PD阴虚动风证大鼠模型[8]，给敦煌颤震方灌胃干预，并利用IlluminaHi Seq平台进行测序，对PD大鼠黑质-纹状体组织进行转录组测序，按照差异基因表达变化FDR≤0.01、log2(Fold Change)≥|1|的原则，正常组和模型组(右侧黑质/右侧纹状体)之间共筛选出143/149个显著性差异表达基因，其中78/86个基因上调表达，65/63个基因下调表达。敦煌颤震方组明显抑制了差异基因的表达富集程度。根据报道，PI3K-Akt信号通路在PD模型小鼠中被激活，抑制体内细胞自噬、促进细胞凋亡[10]。MAPK信号通路激活与氧化应激引起的PD细胞凋亡存在着密切联系，若能抑制MAPK信号通路的激活则可能抑制神经细胞凋亡[11]。cAMP信号通路中cAMP(Cyclic adenosine monophosphate)作为一个经典的第二信使，参与机体的所有生理和病理活动[12]。cAMP表达水平升高，可能通过促进神经细胞存活、再生、分化，从而保护小鼠的认知功能[13]。TNF信号通路在PD的炎症病理过程中起着重要作用。在PD 患者脑脊液和黑质-纹状体系统中，TNF-α表达量较健康对照组增高，提示TNF-α对DA 能神经元造成了损害[14]。近年来，有关cGMP-PKG信号通路信号转导的知识不断涌现，cGMP的作用机制可能涉及调节神经炎症、氧化应激、细胞凋亡、突触可塑性和认知功能[15]。经过敦煌颤震方治疗后，抑制PD模型大鼠上述信号通路的活化，调节细胞自噬、细胞凋亡、神经细胞再生、神经炎症、氧化应激、突触可塑性和认知功能等，这可能是敦煌颤震方发挥抗PD作用的机制。还发现氨基酸、蛋白质、维生素B6等代谢途径与DA能神经元的存活有关。半个世纪以来，DA替代药物左旋多巴-直是PD的临床主导用药，然而该药长期应用会引起患者症状波动和运动障碍[16]。本研究结果显示，敦煌颤震方可望成为DA能神经元保护剂，可再生与修复变性的DA能神经元，值得进一步研究。