2017—2019年上海市虹口区诺如病毒感染性腹泻疫情流行特征

于晓楠，忻郦菁，张静，杨吉星，王斌

上海市虹口区疾病预防控制中心，上海 200082

诺如病毒（norovirus，NoV）属杯状病毒科诺如病毒属，是非细菌性急性胃肠炎的主要病原之一，该病毒引起的急性胃肠炎在每年冬春季高发［1-2］。全球每年约200 000人因感染诺如病毒而致死，多数为发展中国家和地区的儿童［3-4］。诺如病毒是引起我国儿童和成人急性胃肠炎暴发及散发流行的主要病原之一，急性胃肠炎患者诺如病毒的检出率均在20%以上［5］。诺如病毒具有丰富的遗传多样性，根据主要衣壳蛋白VP1 序列的同源性，诺如病毒可分为7 个基因群（GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ、GⅥ以及GⅦ），其中GⅠ、GⅡ和GⅣ是目前已知可以感染人的基因群［6-7］。由于传播途径广泛且缺乏安全有效的疫苗，近年来，诺如病毒感染性腹泻在世界各地多次引发大规模的暴发流行，目前已成为日益严重的公共卫生问题。本研究旨在通过研究虹口区2017―2019年诺如病毒感染性腹泻病例样本的聚合酶RdRp基因和衣壳蛋白VP1基因序列来分析诺如病毒感染性腹泻聚集性疫情流行特征和病原学特征，为今后指导防控工作提供依据。

1 对象与方法

1.1 病例定义

参考《上海市诺如病毒感染性腹泻防控方案（2014版）》制定的病例定义，符合以下临床诊断病例标准者，可初步诊断为诺如病毒感染：潜伏期24～48 h；主要症状为呕吐和腹泻，可伴有恶心、发热和腹痛，儿童病例以呕吐为主，成人病例腹泻为多；病程12～60 h；粪便、血常规检查无特殊发现；排除常见细菌、寄生虫及其他病原感染。确认病例除符合临床诊断病例标准外，在粪便标本或呕吐物中需检测出诺如病毒。

1.2 密切接触者定义

密接接触者就是指与诺如病毒感染确诊病例或临床诊断病例有共同居住、共同生活、共同学习经历的人员，或者暴露于病例呕吐或排泄物的人员，或是根据流行病学调查人员综合评定确定的有其他形式接触的直接接触者。

1.3 聚集性疫情标准

参考《上海市诺如病毒感染性腹泻防控方案（2014版）》制定的疫情标准，诺如病毒感染的聚集性疫情是指：学校、托幼机构等集体单位内同一班级或同一宿舍，1 d内发生1例及以上，或连续3 d 内发生5例以上，以呕吐和（或）腹泻等为主要症状的病例；3 d内出现20 例及以上临床诊断为急性胃肠炎的病例为疑似暴发疫情；一周内出现20 例及以上的诺如病毒感染性腹泻确诊病例为暴发疫情。

1.4 研究对象

2017―2019年上海市虹口区发生的37 起诺如病毒感染性腹泻聚集及暴发疫情病例。所有病例调查采用诺如病毒感染聚集性和暴发疫情个案调查表、上海市病毒性腹泻个案调查表对病例进行个案调查，主要内容包括：一般情况、发病就诊情况、临床表现、流行病学史等相关信息，并对疫情发生单位基本情况及饮食饮水、外环境等情况进行调查。本研究已通过上海市虹口区疾病预防控制中心伦理审查委员会审批（编号：2020-002）。

1.5 采样及检测

采集各类样本共699 份（其中病例粪便、肛拭或呕吐物样本208 份，无症状密切接触者粪便、肛拭或呕吐物样本67 份，从业人员肛拭样本142 份，厨房砧板等环节样本239 份，留样食品样本43 份），送虹口区疾病预防控制中心实验室检测。采用罗氏全自动核酸纯化与加样系统MagNA pure LC 2.0（Roche Applied Science，德国） 进行病毒RNA 的提取，初始样本体积为200 μL，最后洗脱体积为100 μL，提取的核酸分装后置于-80°C冻存。

采用上海伯杰医疗科技有限公司的诺如病毒Ⅰ型/Ⅱ型核酸检测试剂盒（双重荧光PCR 法），使用ABI 7500 实时荧光定量PCR 扩增仪。反应条件：50℃10 min逆转录，95℃ 5 min预变性，95℃ 10 s，55℃ 40 s，40个循环。

采用Onestep RT-PCR 试剂盒（Qiagen，德国）进行RdRp和VP1的部分基因扩增，其中G2SKF/G2SKR引物［8］用于VP1基因（387 bp）扩增，若RT-PCR 结果为阴性则选用CoG2F/G2SKR 引物［9］进行扩增。使用JV12/JV13引物［10］对RdRp基因（326 bp）进行扩增。反应体系为25 μL，由5 μL 5×QIAGEN Onestep RT-PCR Buffer，1 μL DNTP Mix，0.5 μL正向、反向引物（10 mmoL），1 μL QIAGEN Onestep RT-PCR Enzyme Mix 试 剂，12 μL 无Rnase水和5 μL 核酸组成。反应条件：50℃，30 min；95℃，15 min；再按94℃、15 s，60℃、60 s，72℃、60 s，循环40 次；最后72℃，10 min，获得扩增产物。PCR 产物使用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，阳性扩增条带送上海伯杰医疗科技有限公司进行测序。

利用DNAstar 中Seqman 软件对测序结果进行拼接整理，将整理好的序列提交到诺如病毒基因分型网站（http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool/）进行基因分型。从Genbank 中下载国内外GⅡ型诺如病毒相关序列片段，采用MEGA 软件（7.0.14 版本）对病毒RdRp基因和VP1基因核苷酸分别进行序列比对和系统发育树构建。使用邻近法（Neighbor-Joining）绘制进化树，Bootstrap Replications 数值设置为1 000，用于评估进化树的可靠性。

1.6 统计学分析

采用数据进行描述性统计学分析，使用Excel 2010 建立数据库，使用SPSS 16.0 对不同场所诺如病毒聚集性疫情罹患率进行卡方检验分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 疫情概况

2017―2019年上海市虹口区共报告诺如病例聚集疫情37 起，病例数474 例，总罹患率为1.95%（474/24 266）。每起疫情罹患人数中位数11 例，罹患率在0.54%～34.12%间；病例数＜20例的疫情累计33起，病例数≥20 例的疫情共4 起。其中疫情持续时间≤4 d共有5起，5～7 d共有20起，≥8 d有11 起。经采样检测发现，37起疫情中共有29起检出NoV GⅡ（其中5 起疫情检出NoV GⅡ混合札如病毒、NoV GⅠ和金黄色葡萄球菌感染），8起疫情未检出病原。

2.2 流行特征分析

2.2.1 时间分布2017年报告24起，占64.86%（24/37），2018年报告7起，占18.91%（7/37），2019年报告6起，占16.22%（6/37），以2017年流行最为严重。从流行季节分布上，主要发生在冬春季，占总数的78.38%（29/37），见图1。

图1 2017—2019年虹口区诺如病毒聚集性疫情时间分布Figure 1 Temporal distribution of norovirus clusters in Hongkou District,Shanghai from 2017 to 2019

2.2.2 地区分布全区8个街道均有疫情发生，罹患率在0.76%～2.88%之间，罹患率居前3 位的街道依次为嘉兴路街道、曲阳路街道和四川北路街道，见表1。

表1 2017—2019年虹口区诺如病毒聚集性疫情地区分布Table 1 Regional distribution of norovirus clusters in Hongkou District,Shanghai from 2017 to 2019

2.2.3 人群分布报告病例中，年龄最小2岁，最大93岁。2～6 岁儿童143 例，占30.17%，7～11 岁学生217 例，占45.78%；12～18 岁中学学生91 例，占19.20%；19 岁及以上成人23 例，占4.85%。发病人群中，男性265例，女性209，男女性别比为1.27：1。

2.2.4 发生场所分布诺如病毒聚集性疫情发生场所主要在小学（37.84%，14/37）和幼托机构（35.14%，13/37）；不同场所发生疫情报告罹患率在1.67%～2.94%之间，其中幼托机构报告罹患率最高（2.94%）。见表2。

表2 2017—2019年虹口区诺如病毒聚集性疫情发生场所分布情况Table 2 School distribution of norovirus clusters in Hongkou District,Shanghai from 2017 to 2019

2.2.5 临床特征病程1～3 d，均为轻症，临床症状以呕吐为主（89.66%，425/474），部分病例伴有发热、腹泻、腹痛、乏力等其他症状。见表3。

表3 2017—2019年虹口区诺如病毒聚集性疫情临床特征Table 3 Clinical characteristics of norovirus clusters in Hongkou District,Shanghai from 2017 to 2019

2.2.6 传播途径2017―2019年虹口区诺如病毒聚集性疫情主要传播途径为接触传播，达到36起，占97.30%（36/37），病例数444，罹患率3.44%（444/23 458），接触传播和食源性传播1起，占2.70%，发病报告30例，罹患率3.71%（30/808）。对37 起聚集性疫情传播机制分析发现，23 起病例数大于等于10 例的疫情中，病例排泄物处置不当造成疫情蔓延达到17 起，占比73.91%（17/23）。

2.3 病原学特征分析

2.3.1 病原检测情况37 起聚集性疫情的699 份样本中NoV GⅡ核酸阳性130份，阳性率为18.60%。其中病例相关样本检出率为47.12%（98/208），无症状的密切接触者相关样本检出率为29.85%（20/67），从业人员相关样本检出率为7.04%（10/142），厨房砧板等环节样本检出率为0.84%（2/239）。

2.3.2 GⅡ型诺如病毒基因型分布情况对45 份（2017年采集的4 份，2018年采集的22 份，2019年采集的19 份）GⅡ型诺如病毒阳性的病例粪便肛拭样本分别进行了VP1和RdRp的部分基因扩增，其中成功获得VP1基因的样本45 例（2019年19 例，2018年22 例，2017年4 例）和RdRp基因的样本19 例（2019年）。通过测序和序列分析发现，2017年和2018年上海市虹口区诺如病毒VP1基因型为GⅡ.2，而2019年RdRp基因型为GⅡ.P17，VP1基因型为GⅡ.17。

2.3.3 GⅡ型诺如病毒序列对比和进化树构建通过对RdRp基因序列构建系统进化树发现，2019年上海虹口地区疫情的诺如病毒位于GⅡ.P17 分支中LC037415株所在小分支上（自展值94），与LC037415 的核苷酸序列同源性达99.4%～99.6%。

通过对VP1基因序列构建系统进化树发现，2019年上海虹口地区疫情的诺如病毒位于GⅡ.17 分支（自展值为99），核苷酸同源性为98.9%～99.2%。而2017 和2018年上海虹口地区疫情的26 株诺如病毒则聚在GⅡ.2 分支（自展值99），总体同源性为97.9%～100%。具体详见补充材料（http://www.jeom.org/article/cn/10.13213/j.cnki.jeom.20462）。

3 讨论

近年来，国内外研究显示诺如病毒感染性腹泻聚集性疫情呈上升趋势，疫情主要发生在学校、儿童保育中心、疗养院、军事设施和游轮等人员密集、封闭场所［6-7］。为了更全面了解上海市虹口区诺如病毒聚集性疫情流行趋势和病原变化，本课题对2017―2019年虹口区诺如病毒聚集性疫情开展调查分析及病原监测，以便为防控措施的制定提供科学依据。

本研究发现，虹口区诺如病毒聚集性疫情大部分与GⅡ型诺如病毒感染有关，呈现出明显的冬春季流行高峰，这与本市、江浙地区既往研究结果一致［11-13］，但与北京等地流行高峰有所不同［14-15］。诺如病毒感染所致聚集性疫情流行高峰的地域差异，可能与不同地域地理位置、气候环境及病毒流行株型别差异有关，因此，冬春季应作为虹口区诺如病毒聚集性疫情防控的重点时期。

虹口区诺如病毒聚集性疫情在全区8 个街道均有疫情发生，差异可能受到疫情监测敏感性及学校、幼托机构等重点机构分布的影响。幼托机构和小学为诺如病毒聚集性疫情的高发场所，可能与幼儿园人员密集、集体活动频密以及直接或间接接触机会较多有关，且幼儿卫生习惯和防护意识差，免疫力较低造成幼儿易发病。另外，近年来各类教育培训机构的兴起，参加各类课外培训的幼儿数量增加，为病毒传播和疫情扩散提供了条件。

病例的主要症状为呕吐、腹泻、发热，发病儿童呕吐症状多见，可用于聚集性疫情早期识别和病原判定，但呕吐所产生的气溶胶增加了周围人员的暴露风险，加快了病毒的传播和疫情蔓延。

2017―2019年虹口区诺如病毒聚集性疫情主要传播途径为接触传播，与本市既往研究结果一致［11］，与广东省以食源性传播为主不同［16］。对传播机制分析发现，因呕吐物、排泄物处置不当容易造成疫情扩散，研究提示应进一步加强重点机构诺如病毒聚集性疫情防控培训和督导，指导卫生老师和保洁人员规范开展公共场所内呕吐物和排泄物的消毒处置，在儿童和学生中开展有针对性的健康教育，减少和控制疫情的蔓延。本次研究中，经食源性传播聚集性疫情仅报告1 起，但在监测中发现部分从业人员无症状携带并检出病毒，因此落实食源性传播的防范措施，在学校托幼机构、养老院等易感人群密集单位仍具有重要公共卫生学意义。

虹口区37起诺如病毒聚集性疫情病毒检出以GⅡ型为主，诺如病毒感染急性胃肠炎病例和无症状的隐性感染者均可以成为传染源，由于隐性感染者很难发现和隔离，在疾病传播过程的贡献率更高［17］，本研究中密接和从业人员病毒检出率与相关文献报道基本一致［18］。因此，在疫情防控中，在做好病例管理的同时，加强对无症状感染者和从业人员日常健康管理和监测，对其引起的疫情传播风险需高度重视。

相关文献报道［19-20］，我国2015―2016年流行的优势株为GⅡ.P17-GⅡ.17 型，之后是GⅡ.P16-GⅡ.2 型。本研究中通过对虹口区2019年聚集性疫情进行病毒检测和基因分型，首次发现了GⅡ.P17-GⅡ.17 基因型诺如病毒在虹口区的存在。对RdRp基因序列进化分析发现，GⅡ.P17 基因型毒株序列与同一分支上的2015年日本Kawasaki308 病毒株（LC037415）有较近的亲缘性关系。对VP1基因序列进化分析发现，2019年上海虹口地区的诺如病毒与2015年安徽地区报道的一株GⅡ型诺如病毒（MK387010）亲缘关系较近，而2017和2018年上海虹口地区的26株诺如病毒与同期上海市、江苏、浙江地区报道的GⅡ型诺如病毒核苷酸序列亲缘性关系较近。

上述研究提示虹口区GⅡ基因型在遗传进化上与本市、周边省份及日本地区流行株共同循环和传播。由于本次研究检测样本数量有限，后续还需持续开展病原学监测，重点关注病毒株重组的出现，掌握病毒株变异趋势，为做好聚集性疫情应对做好准备。