基于网络药理学探究三叶汤治疗咳嗽的作用和配伍规律

赖艳妮詹少锋刘小虹黄慧婷*

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州510405； 2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州510405）

“咳嗽”在现代医学中是一种常见的呼吸道症状，属于一种重要的防御机制，而在中医学中则属于肺系疾病中独立的病名。《黄帝内经》 中提出“五脏六腑皆令人咳，非独肺也”，认为“咳”本属肺病，但不是肺独有之病，有肺病及于他脏而为咳者，有他脏病及于肺而咳者［1］。《伤寒论》 继承了“五脏六腑皆令人咳”的理论，将咳嗽归纳为六经病症［2］。

三叶汤由“三叶”（枇杷叶、龙脷叶、人参叶）为君，苦杏仁、浙贝母、紫菀、款冬花、桔梗、牛蒡子、防风、木蝴蝶、甘草等相伍组成，是岭南医家治疗多种原因引起的急、慢性咳嗽的经验方，通过临床辨证加减化裁，对治疗鼻后滴流综合征慢性咳嗽［3］、咳嗽变异型哮喘［4］、风燥犯肺型感染后咳嗽［5］、喉源性咳嗽［6］常可获得良好的效果。然而，对于三叶汤治疗咳嗽基础研究的报道仍处于空缺的状态，且中药多成分、多靶点的特点限制了中药的进一步开发和走向国际化。网络药理学从整体观出发，构建药物、分子、靶点、疾病之间的多重网络关系，多层次、全面地阐明中药方剂的药理作用机制［7］，为中医药的发展提供了新的视角。本研究拟通过借助网络药理学的理念和方法，对三叶汤中君、臣、佐、使治疗咳嗽的分子机制和配伍规律进行剖析，为进一步开发和临床运用提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料 TCMSP 数据库［8］（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform／中药系统药理学数据库与分析平台，http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tc⁃msp.php ）；DAVID 数据库（Laboratory of Human Retrovirology and Immunoinformatics，https：／ ／david.ncifcrf.gov）；CTD 数据库（The Comparative Toxicogenomics Database／比较毒物基因组学数据库，http：／ ／ctdbase.org）；Polysearch 数据库（http：／ ／polysearch.cs.ualberta.ca）；STRING 数据库［9］（https：／ ／string⁃db.org／cgi／input.pl）；Venny2.1.0 工 具（http：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html）；Cytoscape3.7.1 软件；gProfiler 工具［10］（https：／ ／biit.cs.ut.ee／gprofiler／gost）。

1.2 三叶汤潜在活性成分及靶点的获取 将评估药物活性的两个重要参数——生物口服利用度≥20%（oral bioavail⁃ability，OB）及类药性≥0.15（Drug⁃likeness，DL）作为初次筛选潜在活性成分的重要阈值［11］（每味中药化学成分中主要的活性成分及特征成分也将纳入为潜在活性成分），从TCMSP 数据库中获得三叶汤潜在活性成分及潜在预测蛋白靶点。利用DAVID 数据库的基因名称转换工具，将蛋白靶点转换为基因名。

1.3 三叶汤治疗咳嗽候选活性成分及靶点的筛选 结合CTD 数据库、Polysearch2 数据库及String 数据库，获得目标疾病（咳嗽）的靶点。使用韦恩图工具Venny2.1.0，将疾病靶点与三叶汤潜在预测靶点进行维恩图的绘制，并筛得三叶汤治疗咳嗽的候选靶点。

1.4 三叶汤治疗咳嗽“药物⁃活性成分⁃靶点”网络及蛋白互作网络的构建 通过整合三叶汤治疗咳嗽的候选活性成分⁃靶点的文本数据，运用Cytoscape3.7.1 软件分别构建三叶汤君药、臣药、佐药、使药组合治疗咳嗽的“药物⁃活性成分⁃靶点”网络。通过软件中的NetworkAnalyzer 工具进行网络拓扑性质分析，同时运用cytoHubba 工具进行Hubba nodes 的分析，获得以degree 为算法的在该网络中排名前70 的核心节点并构建核心节点互作网络。

1.5 基因本位（GO）及KEGG 富集分析 使用gProfiler工具对核心靶点进行GO 富集分析，包括生物学过程（Bio⁃logica lProcess，BP）、细胞组 分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）富集分析。结合Cytoscape 软件中的ClueGO 工具，将核心靶点进行KEGG 富集分析，并使用CluePedia 进行富集网络的可视化。

2 结果

2.1 三叶汤治疗咳嗽潜在活性成分及其靶点信息 通过检索TCMSP 数据库中三叶汤组成药物（枇杷叶、人参叶、龙脷叶）的各自所含化学成分及对应预测靶点，共获得446种化学成分及303 个预测靶点，通过OB 值和DL 值筛选后，剩余潜在活性成分17 种。另外，三味中药中一些没有达到OB 和DL 值阈值的主要活性成分也纳入潜在活性成分中，如龙脷叶中的合金欢基丙酮［12］，枇杷叶中的芦丁、异槲皮苷、熊果酸、齐墩果酸及科罗索酸［13⁃14］。从CTD 数据库中获取的与“咳嗽”相关的靶点共有19 171 个，三叶汤预测靶点中共有277 个靶点与“咳嗽”相关。Degree≥3 的潜在活性化合物详细信息如表1 所示，degree≥3 的潜在关键靶点详细信息如表2 所示。

表1 三叶汤君药组合潜在活性成分基本信息

表2 三叶汤君药组合潜在关键靶点

2.2 网络分析

2.2.1 君药⁃潜在活性成分⁃靶点网络分析 分析网络的拓扑性质可以有效、快速、全面地了解核心活性成分及靶点，有助于进一步掌握三叶汤君药治疗咳嗽的分子作用机制。如图1 所示，该网络共有个271 节点（黄色三角形为中药、紫色圆形为潜在活性成分、红色六边形为靶点），形成的最短路径共有73 170 条（节点间的连线代表相互作用），网络异质性参数为3.352，集中性参数为0.458。Degree 值越大，则节点越大，表明该节点在网络中越为重要。以de⁃gree 为横坐标（X），对应节点数（nodes）为纵坐标（Y），形成的幂函数为Y＝39.638X－0.991，相关性系数为0.963，R2为0.690。

图1 三叶汤君药候选活性成分⁃靶点互相作用网络

2.2.2 君药核心节点网络分析 在三叶汤君药治疗咳嗽Degree 排名前70 的核心“药物⁃活性成分⁃靶点”网络互作图（图2）中，枇杷叶（degree ＝17）和人参叶（degree ＝4）在方药中占据较重要的位置，即对应的活性成分和／或靶点所占比例较多（三角形为中药，圆形为活性成分，六边形为靶点，颜色越深表明该节点在网络中的degree 越大）。活性成分方面，排名较前的分别有MOL000098（degree ＝126）、MOL006821（degree ＝105）、MOL000422（degree ＝56）、MOL000358（degree ＝35）、MOL000354（degree ＝30）、MOL001002（degree ＝17）、MOL000511（degree ＝12）、MOL002372（degree ＝7）、MOL000878（degree ＝ 6）、MOL000415（degree ＝ 6）、MOL005344（degree ＝ 4）、MOL000359（degree ＝ 4）、MOL012588（degree ＝ 4）、MOL012579（degree ＝ 4）、MOL012578（degree＝4）。靶点前列腺素G ／ H 合成酶2（PTGS2）、孕酮受体（PGR）、凝血因子X（F10）、DNA 拓扑异构酶2⁃α（TOP2A）、核受体 辅激活因子2（NCOA2）、Caspase⁃3（CASP3）、细胞凋亡调节因子BAX（BAX）、转录因子p65（RELA）、热休克蛋白HSP 90⁃α（HSP90AA1）、前列腺素G（PTGS1）、凋亡调节因子Bcl⁃2（BCL2）、黄嘌呤脱氢酶（XDH）、转录因子AP⁃1（JUN）、肿瘤坏死因子（TNF）、γ⁃氨基丁酸受体亚基α ⁃1（GABRA1）、磷脂酰肌醇⁃4，5⁃二磷酸3⁃激酶催化亚基γ（PIK3CG）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、雄激素受体（AR）的degree 依次为9、6、6、6、5、5、5、5、5、5、4、4、4、4、4、4、4、4。

图2 三叶汤君药核心节点网络

2.3 君药基因本位（GO）及KEGG 富集分析 运用gPro⁃filer 工具将三叶汤中君药的40 个潜在关键靶点分别进行GO⁃CC（Cellular Component／细胞组 分）、GO⁃MF（Molecular Function／分子功 能）、GO⁃BP（Biological Process／生物过程）。

GO⁃CC 富集结果共有23 个条目具有显著性，显著性前20 的条目（图3）有细胞外空间、细胞质、质膜、细胞外区域、细胞外基质、细胞表面、膜筏、核质、小窝、受体复合物、线粒体外膜、质膜的组成部分、细胞质的核周区域、质膜外侧、细胞外外泌体、线粒体、核染色质、核、突触后膜和血小板α 颗粒腔等细胞组分。

图3 GO⁃CC 富集结果

GO⁃MF 富集结果中具有显著性意义的条目共有27 个，显著性前20 的条目（图4）包括酶结合、蛋白质结合、相同的蛋白质结合、蛋白激酶结合、蛋白质同源二聚化活性、药物结合、转录因子结合、蛋白质异二聚化活性、支架蛋白结合、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA 结合、糖蛋白结合、蛋白酪氨酸激酶活性、序列特异性DNA 结合、RNA 聚合酶Ⅱ核心启动子近端区序列特异性DNA 结合、蛋白激酶活性、转录激活因子活性，RNA 聚合酶Ⅱ核心启动子近端区序列特异性结合、蛋白磷酸酶2A 结合、类固醇激素受体活性、转录因子活性，序列特异性DNA 结合及丝氨酸型内肽酶活性等分子功能。

图4 GO⁃MF 富集结果

GO⁃BP 富集结果共有145 个条目具有显著性，排名前20 的条目（图5）有对药物的反应、对脂多糖的反应、衰老、来自RNA 聚合酶II 启动子的转录的正调节、转录的正调节，DNA 模板化、对雌二醇的反应、细胞增殖的正调节、基因表达的正调节、凋亡过程的负调节、对缺氧的反应、炎症反应、一氧化氮生物合成过程的正调节、细胞对缺氧的反应、对乙醇的反应、血管生成的正调节、细胞对机械刺激的反应、对有毒物质的反应、ERK1 和ERK2 级联的正调节、平滑肌细胞增殖的正调节。

图5 GO⁃BP 富集结果

40 个潜在关键靶点KEGG 富集分析结果（图6）表明，三叶汤君药治疗咳嗽主要涉及低氧诱导因子⁃1（HIF⁃1）、肿瘤坏死因子（TNF）、磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）等信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、I 型跨膜蛋白质（Toll 样受体）、血管内皮生长因子（VEGF）和松弛素（Relaxin）信号通路。与肺部疾病相关的疾病信号通路包括小细胞肺癌、结核、甲型流感、百日咳等。最后利用Cytoscape 软件中的CluePedia 工具将40 个潜在关键靶点富集的疾病通路与相关基因进行网络的构建和可视化（图7），不同颜色代表不同的簇（cluster），颜色相同代表功能组分相似，这有利于进一步探讨潜在目标基因与疾病通路之间的相互作用。

图6 KEGG 富集结果

图7 KEGG 富集信号通路⁃基因网络

2.4 臣⁃佐⁃使药组合的网络分析 中医药治疗疾病注重君臣佐使相伍相配，以达到最好的药效发挥作用。为了更好地理解三叶汤中“臣⁃佐⁃使”药的作用特点及配伍规律，分别对方中的臣药组合“苦杏仁⁃款冬花⁃浙贝母⁃紫菀”、佐药组合“木蝴蝶⁃桔梗⁃防风⁃牛蒡子”及使药“甘草”进行网络药理的剖析，同时构建药物⁃活性成分⁃靶点网络图（图8～10）。红色正方形为中药，绿色三角形为活性分子，黄绿色圆形为靶点。基于OB、DL 值，同时通过文献查阅保留每味中药的主要活性成分和特征成分，初步共筛得211 个候选活性成分（未给出），针对疾病“咳嗽”进一步筛得75 个潜在活性成分（表3）和16 个预测靶点（表4）。

表4 臣⁃佐⁃使药预测靶点

图8 臣药组合网络分析图

表3 臣⁃佐⁃使药潜在活性成分

臣药组合共筛选出18 个化合物和12 个与“咳嗽”相关的靶点（图8）。靶点分别为F2、NOS3、EGF、VEGFA、SERPINE1、ADRA2A、ADRA2B、OPRD1、DRD2、OPRM1、OPRK1、ADRA2C。KEGG 富集分析表明其主要与信号通路神经活性配体⁃受体相互作用及HIF⁃1 信号通路相关联；GO功能分析提示其主要涉及调节体液水平、磷脂酶C 激活G蛋白偶联受体信号传导途径、金属离子传输的调节、激酶活性的正调节和调节钾离子的转运、白细胞介素⁃4 和白细胞介素⁃13 信号传导等分子功能；

佐药组合共筛选出30 个化合物和12 个与“咳嗽”相关的靶点（图 9）。F2、OPRM1、NOS3、ALB、EDN1、SERPINE1、GCG、PYY、VEGFA、ADRA2A、EGF、ADRA2B。KEGG 富集提示其与HIF⁃1 信号通路相关；GO 功能分析表明第二信使介导的信号传导、调节体液水平、离子传输的调节、信号受体活性的调节、伤口愈合的积极调节、对神经系统发育的积极调节、组织稳态血小板激活，信号传导和聚集及GPCR 配体结合与其关系密切；

图9 佐药组合网络分析图

使药共筛选出38 个化合物和8 个与“咳嗽”相关的靶点（图 10 ）。OPRM1、F2、OPRD1、NOS3、STAT3、VEGFA、EGF、SERPINE1。KEGG 富集提示HIF⁃1 信号通路与其显著相关；GO 功能分析表明其与钙离子转运、受体介导的内吞作用的正调节、血液凝固的负调节、神经系统过程的调节、急性炎症反应及白细胞介素⁃4 和白细胞介素⁃13信号传导等分子功能密切相关。

图10 使药网络分析图

3 讨论

三叶汤是岭南医家以疏风润肺止咳为组方原则，以止嗽散加减所创。用以治疗岭南地区治疗多种原因引起的急、慢性咳嗽。方中“三叶”枇杷叶、龙脷叶、人参叶清均为清轻之品，借“治上焦如羽，非轻不举”之法，清化相配，降润相合，为治疗肺家咳嗽之良药。三叶汤化裁后对鼻后滴流综合征慢性咳嗽（风痰肺燥型）［3］、咳嗽变异型哮喘［4］、风燥犯肺型感染后咳嗽［5］、喉源性咳嗽［6］等疗效显著。

在临床疗效确切的前提下，本研究拟借助网络药理学的研究方法，从细胞、分子层面剖析三叶汤中君⁃臣⁃佐⁃使药的配伍规律和药理作用机制。在筛选出来的15 个君药潜在活性成分中一些活性成分已有治疗肺系疾病的相关研究报道：如研究表明人参皂苷Rh2（G⁃Rh2）对小鼠哮喘具有保护作用，其机制可能与抑制磷酸化AKT、p38MAPK 以及NF⁃κB 信号通路有关［15］。槲皮素能通过抑制炎性介质TNF⁃α、IL⁃8 的释放而改善ALI 大鼠的气体交换功能，从而减轻内毒素诱导的急性肺损伤［16］。异鼠李素作为槲皮素的中间代谢产物，对脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）模型有保护作用［17］，可在体内和体外通过调控MAPKs 和NF⁃κB 信号通路显著抑制TNF⁃α，IL⁃1β 和IL⁃6 的分泌，减轻ALI 模型的中性粒细胞浸润及水肿。

对40 个君药关键靶点进行KEGG 富集，结果提示三叶汤君药治疗咳嗽的药理作用机制可能与松弛素、低氧诱导因子⁃1、VEGF 等信号通路有关。研究表明，松弛素（relaxin，RLX）对肺有保护作用，可通过激活cAMP／PKA 途径增强Epac 协同PKA 抑制ERK1／2 磷酸化，减轻ASMCs 增生来减轻气道炎症反应［18］。低氧诱导因子⁃1（HIF⁃1）在LPS 导致的大鼠急性肺损伤中HIF⁃1 可通过VEGR、SDF1 及CXCR4等靶基因的表达促进肺损伤的修复［19⁃20］。VEGF 是哮喘气道重塑和炎症的介质，可通过刺激血管内皮细胞的增殖、增加血管通透性来促进支气管内新血管的生成［21］。

对臣药⁃佐药⁃使药组合进行网络药理剖析，发现均可通过HIF⁃1 信号通路，协同君药调节巨噬细胞等炎症细胞介导的炎症反应并及时促进肺损伤的修复。同时臣药组合还与白细胞介素⁃4 和白细胞介素13 的水平密切相关，而研究表明白细胞介素4 和13 分别在咳嗽变异型哮喘、支气管哮喘的急性发作期起重要作用［22⁃23］。

综上所述，三叶汤君药可能是通过调控松弛素、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子、低氧诱导因子⁃1、I 型跨膜蛋白质等信号通路，抑制气道炎症反应，减轻气道重塑，促进支气管内心血管的生成，减轻肺部损伤，从而达到治疗小细胞肺癌、结核、甲型流感、百日咳等肺部疾病的作用。臣⁃佐⁃使药则可通过调节HIF⁃1 信号通路、白细胞介素⁃4 和白细胞介素13 的水平协助君药抑制炎症反应，减轻肺部损伤，达到协同配伍的作用。本研究借助网络药理学的研究方法，筛选了三叶汤治疗“咳嗽”的关键靶点和潜在活性分子，初步探讨了君药⁃臣药⁃佐药⁃使药的药理作用机制和协同配伍作用特点，为三叶汤的进一步开发和临床运用提供了科学依据。