基于网络药理学探究九香虫肾保护作用机制

何天目段灿灿侯晓晖李晓飞张建永*

（1.遵义医科大学基础医学院，贵州 遵义563003； 2.遵义医科大学药学院，贵州 遵义563003； 3.遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义563003）

九香虫是半翅目蝽科兜蝽属九香虫（Aspongopus chinensisDallas）的干燥体，别名打屁虫、屁巴虫等，广泛分布于贵州、云南、四川等地，是我国传统中药昆虫。始载于《本草纲目》：“咸温无毒，用于膈脘滞气，脾肾亏损，壮元阳”。《本草新编》 中记载：“虫中之至佳者，亦兴阳之物，以扶衰弱最宜”［1］，古籍皆强调了其对肾的补益作用。2020 年版《中国药典》 收录九香虫，认为其归肝、脾、肾经，具有理气止痛，温中助阳的功效，主治肾虚阳痿，胃寒胀痛等［2］。同时九香虫在民间常用于泡酒，具有补肾壮阳、理气止痛、兴阳益精之功效［3］。九香虫发挥肾保护作用的功效屡有记载，其机制可能与尿素循环、抑制转化生长因子基因磷酸化、抗炎等有关［4⁃9］，但其具体分子机制尚不清楚。

网络药理学是基于“药物⁃靶点⁃疾病”相互作用网络关系，通过分析基因、疾病、药物等网络库的关联，利用专业算法及网络分析软件，整体揭示“药物⁃靶点”、“靶点⁃疾病”、“药物⁃疾病”互作的奥秘，揭示复杂药物协同作用于人体的奥秘，并指导临床精准用药及新药研发［10］。目前，网络药理学已经被广泛用于中药肾毒性等的研究中，如有研究采用网络药理学方法分析雷公藤肾毒性［11］、商陆肾损伤［12］、朱砂安神丸肝肾解毒等作用机制［13］，为其临床应用提供参考。

综上，本研究拟采用网络药理学及分子对接技术探讨九香虫肾保护作用机制，为提高九香虫的药用效应，扩大其临床应用提供新的线索。

1 方法

1.1 九香虫活性成分筛选及靶点预测 本研究通过检索中国知网、万方、Pubmed、Web of Science 等国内外数据库，获取九香虫主要化学成分，经Pubchem 数据库（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）验证和转化，并整理分类。

1.2 九香虫靶点预测及网络构建 采用Chemdraw19.0 软件绘制活性成分的结构后输入到 Targetnet 数据库（http：／ ／targetnet.scbdd.com／）预测作用靶点，筛选条件为：预测准确率（Accuracy，AUC）＞＝0.7，预测概率（Probability，Prob）＞0.9［14］。并经Uniprot（https：／ ／www.uniprot.org／）校正和转化，确定物种为“Homo sapiens”的靶点。进一步采用Cytoscape3.7.0 软件构建九香虫“成分⁃靶点”网络，并运用Network Analyzer 插件分析网络拓扑参数。

1.3 九香虫肾保护作用潜在靶点预测 通过在GeneCards数据库（http：／ ／www.genecards.org／）、比较基因组学毒理数据库（The Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：／ ／ctdbase.org／）、Digsee 数据库（https：／ ／210.107.182.71／geneSearch／）中输入 关键词“肾毒性（nephrotoxicity）、肾损伤（renal injury、kidney injury）”，筛选已报道的、标记有“marker／mechanism”的基因，剔除重复基因，得到肾损伤靶标数据库，并经Uniprot 校正，筛选物种为“Homo sapiens”的靶点，利用image GP 工具（http：／ ／www.ehbio.com／ImageGP／index.php／）绘制维恩图整合九香虫肾保护共同靶点。

1.4 蛋白相互作用网络与“核心成分⁃靶点”网络构建String［15］（Search Tool for the Retrieval of InteractingGenes／Proteins，Version：11.0，http：／ ／string⁃db.org／）数据库旨在整合所有可公开获得的蛋白质⁃蛋白质相互作用信息来源，搜寻已知蛋白质和预测蛋白质之间相互作用的系统。将九香虫肾保护共同靶点导入String 数据库，选用Multiple proteins 工具，筛选物种为人源，选取高置信度（high con⁃fidence，0.7），获取蛋 白相互作用。将其导 入Cytoscape3.7.0 软件绘制蛋白相互作用网络（protein protein interaction network，PPI network），并与“成分⁃靶点”网络图进行融合（Merge），运用Network Analyzer 插件分析网络拓扑参数，筛选出节点度高于平均值的节点进一步构建“核心成分⁃靶点”网络，用于后续分析。

1.5 核心靶点基因功能及通路分析 Enrichr［16］数据库（http：／ ／amp.pharm.mssm.edu／Enrichr／＃）常用于基因富集分析，包含来自102 个基因集库的180 184 个带注释的基因集。同时将“1.4”项下筛选后的核心靶点导入Enrichr 网站，选取GO 生物进程（Biological Process）、细胞组分（Cellular Component）、分子功能（Molecular Function）及Pathways（KEGG 2019 Human）进行GO、KEGG 通路富集分析。以P＜0.05 为条件，依据综合得分（combined score），通过image GP 工具绘制“GO 细胞组分、分子功能及生物进程富集分析”及“KEGG 通路富集气泡图”。

1.6 iGEMDOCK 分子对接 iGEMDOCK［17］是开源的分子对接软件，用于系统评估和活性筛选，通过基于对接位点（蛋白质⁃配体作用）和化合物性质（原子组成）使用k⁃均值和分层聚类方法提供后分析工具，能直接导入配体分子进行对接，并且允许多个配体同时进行对接。其能量打分函数通过蛋白质⁃化合物相互作用的静电、氢键和范德华力打分，结果以能量的高低去判断结合程度，化合物分子与受体结合的构象稳定时能量越低，结合性越高。将九香虫核心成分与靶点进行分子对接，并以肾保护药物卡托普利（Captopril，Pubchem ID：44093）及氯沙 坦（Losartan，Pubchem ID：3961）作为阳性对照药［18⁃19］。具体方法为，首先在在PDB 数据库（https：／ ／www.rcsb.org／）中搜索靶点的蛋白结构，限定物种为人，以PDB 格式上传后选择限定配体（bounded ligand）类型准备对接；核心成分通过Chem 3D 19.0 软件使化合物能量最小化后以Mol 格式上传后选择标准对接模式进行分子对接，具体对接参数为generic evolutionary method ＝200、generation ＝70、number of solution＝2。

2 结果

2.1 九香虫活性成分筛选 通过检索国内外文献，经Pubchem 转化，剔除相同成分，共筛选到九香虫活性成分93 种，见表1，且与文献报道的九香虫主要活性成分相符。主要分为核苷酸类（18 种）、多巴胺类（18 种）、营养成分（16 种）、芳香类成分（5 种）及其他成分（36 种）。其中，多巴胺类（±）⁃Aspongamide A、Aspongopusamide A、N⁃乙酰多巴胺及3，4⁃二羟基苯丙酮等肾保护作用成分在本研究中均被收录［4⁃5］。

表1 九香虫主要活性成分

续表1

续表1

2.2 九香虫靶点预测及网络构建 采用Targetnet 数据库预测93 个活性成分的作用靶点，并经Uniprot 校正后共获取靶点288 个。进一步采用Cytoscape3.7.0 软件构建九香虫“成分⁃靶点”网络，见图1。其中，按照度值大小排名前五的成分为1，2⁃苯二醇（O22，degree＝83）、2，3⁃丁二醇（O31，degree ＝79）、3，4⁃二羟基苯乙醇（O23，degree ＝72）、十三烷（Q1，degree ＝70）、十二烷二酸（Y9，degree＝70）；排名前五的靶点为碳酸酐酶6（Carbonic anhydrase 6，CA6，degree ＝69）、碳酸酐 酶7（Carbonic anhydrase 7，CA7，degree＝65）、碳酸酐酶5B（Carbonic anhydrase 5B，CA5B，degree ＝64）、碳酸酐酶5 A（Carbonic anhydrase 5 A，CA5A，degree ＝63）、羧酸酯酶2（Cocaine esterase，CES2，degree＝59）。

图1 九香虫“成分⁃靶点”网络

2.3 九香虫肾保护作用潜在靶点预测 以肾毒性（nephro⁃toxicity）及肾损伤（renal injury、kidney injury）为关键词在GeneCards 数据库检索到靶点1 432 个、CTD 数据库检索到102 个、Digsee 数据库检索到279 个，去除重复靶点，并经Uniprot 校正整合共得到肾毒性相关靶点1 565 个。肾毒性相关1 565 个靶点与九香虫288 个靶点取交集得到九香虫发挥肾保护作用潜在靶点104 个，用于后续进一步分析。

2.4 蛋白相互作用（PPI）与“核心成分⁃靶点”网络构建分析 将九香虫肾保护104 个靶点蛋白导入String 数据库中，获取相互作用关系，去除孤立靶点后得到94 个靶点蛋白，随后将结果导入Cytoscape 3.7.0 软件构建PPI 网络，见图2。并与“成分⁃靶点”网络图进行融合，去除孤立节点共有182 个节点。其中88 个节点代表九香虫成分，平均度值为10.55，大于平均度值的成分有49 个；94 个节点代表九香虫肾保护靶点，平均度值为16.02，大于平均度值的靶点有36 个，将49 个活性成分与36 个靶点构建“核心成分⁃靶点”网络，见图3，运用Network Analyzer 插件按照度值大小排名前10 核心成分、靶点见表2。

表2 九香虫肾保护核心成分⁃靶点（Top10）

图3 九香虫肾保护“核心成分⁃靶点”网络

图2 蛋白质⁃蛋白质相互作用网络

2.5 GO 富集分析和KEGG 靶点通路注释分析 将筛选出的36 个核心靶点导入Enrichr 数据库，以P＜0.05 为条件进行GO 富集分析及KEGG 通路注释分析，结果按综合得分大小排列。GO 分析得到686 个生物进程、90 个分子功能及29 个细胞组分，结果见图4（Top10）。KEGG 通路注释分析，共富集到91 条关键通路，根据综合得分大小取前20条通路，并用image GP 工具进行可视化，见表3、图5。

表3 KEGG 通路富集分析（Top20）

图4 GO 细胞组分、分子功能及生物进程富集分析（Top 10）

图5 KEGG 通路富集气泡图（Top 20）

2.6 iGEMDOCK 分子对接 采用iGEMDOCK V2.1 软件将九香虫肾保护“核心成分⁃靶点”网络中的49 个核心成分与度值较高的10 个核心靶点选择对接位点后进行分子对接，见表4，其中Toll 样受体（Toll⁃like receptor 9，TLR9）因无人源蛋白结构未进行分子对接。配体与受体结合的构象稳定时能量越低，结合可能性越大。其分子对接结果见图6，1，2⁃脱氢⁃N⁃乙酰基多巴胺（D1）、3，4⁃二羟基苯基乙酸（O24）、阿斯吡嗪（O16）、亚麻酸（Y6）等结合性较强，且与阳性药结果相似，内皮型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，endothelial，NOS3）、花生四烯酸5⁃脂氧合酶（Arachidonate 5⁃lipoxygenase，ALOX5）、组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase 4，HDAC4）、转录因子（Transcription factor p65，RELA）及半胱天冬酶9（Caspase⁃9，CASP9）等靶点结合性也较高。其中NOS3 靶点与成分3，4⁃二羟基苯基乙酸（O24）及1，2⁃脱氢⁃N⁃乙酰基多巴胺（D1）结合性较强，见图7。

图6 九香虫肾保护靶点分子对接结果

表4 九香虫肾保护靶点分子对接信息

图7 NOS3 与O24、D1 最佳对接形式

3 讨论

传统中医理论认为肾为“先天之本”、“生命之源”，肾具藏精、主水、主纳气、主骨、生髓等功效［20］。九香虫作为传统中药，因其补肾壮阳、兴阳益精、气血双宣之功效而被广泛药食两用，正如民间常说“有钱人吃人参鹿茸，无钱人吃打屁虫”。目前研究发现，九香虫水提取物灌胃肾阳虚小鼠后，小鼠血清中尿素含量下降，力竭游泳时间延长，具有肾保护作用［1］。九香虫提取物Aspongopusamide A、N⁃乙酰多巴胺及3，4⁃二羟基苯丙酮等可能通过抑制环氧合酶⁃2（Prostaglandin G／H synthase 2，COX⁃2／PTGS2）对高糖诱导的系膜细胞发挥肾保护作用［4］。也有研究发现九香虫中（±）⁃Aspongamide A 在肾细胞上能抑制转化生长因子（transforming growth factor⁃β1，TGF⁃β1）诱导的基因磷酸化，并能抑制高糖诱导的促细胞炎症因子和胶原分泌，在慢性肾病及肾纤维化上发挥肾保护作用［5］。同时，结合本研究中“PPI”网络及通路富集分析进一步探析发现，Aspongopusamide A、N⁃乙酰多巴胺及3，4⁃二羟基苯丙酮可能通过基 质金属 蛋白酶9（Matrix metalloproteinase⁃9，MMP9）、环氧合 酶⁃1（Prostaglandin G／H synthase 1，PTGS1）、TLR9、ALOX5 等靶点间接作用于COX⁃2 靶点，且与调节白细胞介素17（interleukin 17，IL⁃17）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信号通路、5⁃羟色胺能突触及花生四烯酸代谢有关。此外，TLR9、PTGS1 及ALOX5 等靶点在“核心成分⁃靶点”网络中度值均较高，表明本研究预测较准，同时新发现的靶点通路，为进一步研究提供了参考。因此开展网络药理学研究对于更好揭示九香虫肾保护作用具有一定意义。

3.1 九香虫肾保护“多成分⁃多靶点⁃多通路”特点与分子对接验证 经九香虫肾保护“核心成分⁃靶点”网络及KEGG 通路富集分析，九香虫发挥肾保护作用的核心成分有49 个，核心靶点36 个，关键通路达91 条，揭示了九香虫发挥肾保护作用是通过多成分、多靶点、多通路共同作用的机制。经分子对接验证，阿斯吡嗪、亚麻酸、1，2⁃脱氢⁃N⁃乙酰基多巴胺等可能是发挥肾保护作用的活性成分。核心“成分⁃靶点”网络中度值较高的NOS3、ALOX5、HDAC4 及RELA 等核心靶点与九香虫成分结合性也较强，提示本次靶点预测准确性较高。整合网络及通路富集分析，九香虫可能通过“肾素分泌”、“肾素⁃血管紧张素系统”、花生四烯酸代谢、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、精氨酸代谢等通路发挥肾保护作用，并将以上通路结果可视化，见图8。

图8 关键KEGG 通路分析

3.2 九香虫可能通过“肾素分泌”、“肾素⁃血管紧张素系统”发挥肾保护作用 血管紧张素转换酶（Angiotensin⁃converting enzyme，ACE）、前列腺素E2 受 体EP2 亚型（Prostaglandin E2 receptor EP2 subtype，PTGER2）、前列腺素E2 受体EP4 亚型（Prostaglandin E2 receptor EP4 subtype，PTGER4）和腺苷受体 A1（Adenosine receptor A1，ADORA1）靶点参与了肾素分泌通路；ACE、氨肽酶（Aminopeptidase N，ANPEP）靶点参与了“肾素⁃血管紧张素系统”通路。其中，ACE 可作用血管紧张素Ⅱ（Angio⁃tensin Ⅱ，AngⅡ）生成肾素，发挥收缩血管和刺激醛固酮分泌的生理效应。有研究发现ACE 活性降低可导致AngⅡ水平降低，从而保护肾细胞［21］。有研究发现抑制糖尿病肾病小鼠COX⁃2 表达下调尿前列腺素E2 水平抑制肾素分泌发挥肾保护作用［22］。因此，九香虫可能通过作用于ACE 等靶点，通过调节肾素分泌等发挥肾保护作用。

3.3 九香虫肾保护可能与花生四烯酸代谢、VEGF 信号通路有关 PTGS2、ALOX5、PTGS1 靶点参与了花生四烯酸代谢途 径，PTGS2、CASP9、NOS3、蛋白激酶（RAC⁃alpha serine／threonine⁃protein kinase，AKT1）参与了VEGF 信号通路。VEGF 通路下游丝裂原活化蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）通路是肾毒性的关键抑制通路［23］，且VEGF 信号通路与花生四烯酸代谢相关，PTGS2 是其共同作用靶点。也有研究发现，花生四烯酸可引起人肾小球足细胞凋亡［24］。PTGS2 是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，PTGS2 在肾损伤中高度表达。有研究发现，PTGS2 水平降低在多种药物致大鼠肾损伤模型的保护中发挥作用［25⁃26］。还有研究发现，PTGS2 抑制剂对大鼠肾间质纤维化有保护作用［27］。因此，九香虫可能通过影响VEGF信号通路及花生四烯酸代谢调节PTGS2 表达发挥肾保护作用。

3.4 九香虫肾保护可能与精氨酸代谢有关 本研究发现，神经型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，brain，NOS1）、诱导型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，inducible，NOS2）及NOS3 靶点参与了精氨酸代谢通路，且NOS3 靶点在分子对接验证中结合性较强。肾脏在精氨酸代谢中扮演重要角色，而一氧化氮合酶是一种同工酶，在肾单位中广泛表达。精氨酸在人体内通过鸟氨酸循环，参与尿素的形成［28］。有研究发现金匮肾气丸及六味地黄丸可通过影响精氨酸代谢发挥肾保护作用［29］。也有研究发现，二恶烷肾毒性［30］、阿奇霉素肾毒性［31］、多囊肾病发生［32］、肾移植术后急性肾损伤也与精氨酸代谢途径有关。因此，九香虫可能通过影响精氨酸代谢调节尿素循环等发挥肾保护作用。

综上所述，本研究通过网络构建及分子对接等一系列整合分析从系统层面揭示九香虫肾保护“多成分、多靶点、多通路”的分子作用机制。发现阿斯吡嗪、亚麻酸、1，2⁃脱氢⁃N⁃乙酰基多巴胺及NOS3、ALOX5、HDAC4、RELA 等潜在治疗成分与靶点，可能通过调节“肾素分泌”“肾素⁃血管紧张素系统”、花生四烯酸代谢、VEGF、精氨酸代谢等通路有关，为九香虫肾保护作用机制研究及其资源进一步开发应用提供参考。