火绒草对系膜增生性肾小球肾炎炎症反应的影响

赵 玥王光函张 颖姜 鸿齐 越

（辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳110034）

火绒草Leontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.为菊科火绒草属植物火绒草，具有清热凉血、益肾利水的功效［1］。现代医学表明，火绒草具有抗炎、抗氧化等多种药理活性［2⁃3］，民间主要用于治疗流行性感冒、急（慢）性肾炎、蛋白尿血尿等疾病［4］。系膜增生性肾小球肾炎（Mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）为慢性肾小球肾炎，以蛋白尿、血尿、水肿等为主要临床表现［5］。其发病机制复杂，炎症细胞浸润等多种因素相互作用都可影响MsPGN 疾病的发生和发展［6］。曾有报道研究火绒草对系膜增生性肾小球肾炎的治疗作用［7］，但基础研究较少，相关的作用机制及调控的靶点也未明确，因此考察火绒草治疗肾炎的作用机制具有重要意义。根据中药多成分、多途径、多靶点的特点，本研究通过对MsPGN 大鼠模型血清炎症因子的测定以及肾脏组织中蛋白表达的检测，探索火绒草对MsPGN 疾病的治疗作用及调控机制，为火绒草的临床应用及抗炎制剂的进一步开发利用提供科学依据。

1 材料

1.1 动物 SPF 级健康SD 雄性大鼠75 只，体质量180～220 g（辽宁长生生物技术有限公司），实验动物生产许可证号SCXK（辽）2015⁃0001。

1.2 试剂 牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（德国Sigma 公司，批号WX⁃BC7359V、SLBV6895、SLBT5128）；白介素6（interleukin 6，IL⁃6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF⁃α）大鼠酶联免疫分析试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号m1064292、m1002859）；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺上样缓冲液（SDS⁃PAGE loading Buffer）（北京康为世纪生物科技有限公司，批号01411／40342）；二喹啉甲酸（bicin⁃choninic acid，BCA）；蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号P0012）；核因子⁃κB p65（nuclear factor kappa⁃B p65，NF⁃κB）、磷酸化蛋白激酶B（p⁃protein kinase B，P⁃AKT）（美国Cell Signaling Technology 公司，批号82427T、4060T）；蛋白激酶B 1／2／3（protein kinase B 1／2／3，AKT1／2／3）、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）（英国Abcam 公司，批号GR242901⁃30、GR3245955⁃1），上述抗体稀释1 000 倍使用；磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶（p⁃phosphatidylinositol 3 kinase，P⁃PI3K）、肌动蛋白（β⁃Actin）（北京博奥森生物技术有限公司，批号AH08106421、AH01032107），稀释400 倍使用。

1.3 药物 火绒草药材（野生，采于辽宁沈阳祝家镇，160601，由辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为正品）。雷公藤多苷片（上海复旦复华药业有限公司，批号171201）；盐酸贝那普利片（北京诺华制药有限公司，批号X2657）。

1.4 仪器 恒温培养箱（厦门医疗电子仪器厂）；离心机（美国Thmorgan 公司）；组织研磨机（CK1000D，上海力申科学仪器有限公司）；酶标仪（Neofuge 13R，美国伯腾仪器公司）；Elx800 酸度计（PHS⁃25C，上海康仪仪器有限公司）；垂直电泳槽湿转膜系统（美国Bio⁃Rad 公司）。

2 方法

2.1 火绒草提取物的制备 取火绒草药材150 g，加入10倍量水，回流提取2 h，滤过，残余药渣加入8 倍量水，提取1 h，滤过，合并2 次滤液，备用。

2.2 MsPGN 模型的建立［7］所有SD 大鼠适应性饲养1周，按体质量随机选取10 只作为空白组，其余65 只用于建立MsPGN 模型。取各组大鼠称定质量，10%水合氯醛腹腔注射（300 mg／kg）麻醉，进行左侧肾脏切除手术。将麻醉后大鼠放置于无菌操作台上，固定、备皮，手术部位涂抹碘伏、75%乙醇进行消毒，沿左肋脊角入口剪开，暴露肾脏，用手术线快速结扎左侧肾脏动、静脉和输尿管，剪下左侧肾脏，用青霉素钠处理结扎处，缝合伤口并消毒，涂抹火棉胶。手术一周后，除空白组外，其余大鼠均皮下注射0.1 mL A 液（弗氏完全佐剂＋3.0 mg BSA），于第1 周末、第2 周末大鼠皮下注射0.1 mL B 液（弗氏不完全佐剂＋3.0 mg BSA）；于第3 周末，大鼠腹腔注射BSA，连续4 次，间隔1 h，剂量分别为每只0.5、1.0、1.5、3.0 mg。次日大鼠腹腔注射2.0 mg BSA。于第4 周起大鼠每日腹腔注射BSA，开始剂量为0.5 mg，每日增加0.5 mg，直至5.0 mg，继续每周加量1 mg 至10 mg 为止。于第5 周末大鼠尾静脉注射脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）100 μg。空白组大鼠麻醉后手术暴露左侧肾脏，但不做切除，其余步骤同造模组，皮下、腹腔均注射生理盐水，称为假手术组。除麻醉意外死亡2 只，剩余大鼠造模结束后收集大鼠24 h 尿液做尿常规检查，将尿蛋白检测为阴性的3 只大鼠剔除，剩余大鼠分为模型组，中药阳性药组（雷公藤多苷片20 mg／kg），西药阳性药组（盐酸贝那普利片40 mg／kg），火绒草高、中、低剂量组（2.70、1.35、0.68 g／kg），每组10 只。各组模型大鼠在次日开始连续灌胃给药15 mL／kg，每日给药1 次，给药时间为5 周，假手术组与模型组均给相同容量的水。

2.3 血清肌酐、血清尿素氮生化指标的测定 给药结束后，所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛（300 mg／kg）麻醉，进行腹主动脉采血，3 000 r／min 离心10 min，取上清，－80 ℃冻存，按照试剂盒说明书进行血清肌酐、血清尿素氮的测定。

2.4 炎症指标的测定 取大鼠血清，按照试剂盒说明书进行IL⁃6、TNF⁃α 的测定。

2.5 肾脏组织病理学形态观察 大鼠腹主动脉取血后立刻解剖摘取右侧肾组织，迅速沿冠状面将肾脏切为大致相等的两半，其中一半投入10%中性福尔马林溶液中固定以备HE 染色观察，另一半置于液氮瓶中保存。

2.6 相关蛋白的检测 取液氮保存的肾脏组织，采用Western blot 法检测肾脏组织中核因子⁃κB（NF⁃κB）、阻遏蛋白（IκB）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）蛋白表达。

2.7 统计学分析 采用SPSS 13.0 软件对实验数据进行单因素方差分析，数据用（）表示。首先对数据进行正态性检验，符合正态分布的，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐则采用最小显著差法进行两两比较，方差不齐则采用Dunnett’s T3 检验进行两两比较；若不符合正态分布，则采用非参数检验进行统计分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 火绒草提取物对血清肌酐及血清尿素氮的影响 由表1 可见，与假手术组相比，模型组中血清肌酐及血清尿素氮水平增加（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，火绒草提取物高剂量组可降低大鼠血清肌酐水平（P＜0.05），高、中、低剂量组可降低大鼠血清内尿素氮水平（P＜0.05，P＜0.01）。雷公藤多苷组可降低血清肌酐及血清尿素氮水平（P＜0.05，P＜0.01），盐酸贝那普利片组可降低血清尿素氮水平（P＜0.05）。见表1。

表1 火绒草提取物对血清中血清肌酐及血清尿素氮水平的影响（）

表1 火绒草提取物对血清中血清肌酐及血清尿素氮水平的影响（）

注：与假手术组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 火绒草提取物对TNF⁃α、IL⁃6 的影响 由表2 可见，与假手术组相比，模型组血清中TNF⁃α、IL⁃6 水平增加（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，火绒草提取物高、中剂量组可降低血清中TNF⁃α 水平（P＜0.05，P＜0.01），火绒草提取物高剂量组可降低大鼠血清内的IL⁃6 水平（P＜0.05）。雷公藤多苷组可降低TNF⁃α、IL⁃6 水平（P＜0.05）。见表2。

表2 火绒草提取物对血清中TNF⁃α、IL⁃6 水平的影响（）

表2 火绒草提取物对血清中TNF⁃α、IL⁃6 水平的影响（）

注：与假手术组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 火绒草对MsPGN 模型大鼠HE 染色形态学观察结果 由图1 可见，假手术组显微镜下可见该组大鼠肾小球结构无明显变化，系膜细胞及胞外基质无明显增多，无炎性细胞浸润。模型组可见该组大鼠肾小球明显肥大，肾小球偶见萎缩，系膜区细胞弥漫性增多、胞外基质增生，肾间质炎性细胞浸润，肾小管坏死。火绒草提取物高剂量组可见该组大鼠肾小球结构轻度变化，系膜细胞、基质轻度增生，系膜区无增宽，少有炎症细胞浸润。火绒草提取物中、低剂量组，可见该组大鼠肾小球结构改变，系膜细胞、基质轻度增生，有炎症细胞浸润。雷公藤多苷组可见该组大鼠肾小球肥大不明显，系膜细胞、基质轻度增生，炎症细胞浸润不明显。盐酸贝那普利片组可见该组大鼠肾小球及毛细血管壁无受损，系膜细胞轻度增生，胞外基质基本正常，炎症细胞浸润不明显。见图1。

图1 肾脏组织HE 染色

3.4 火绒草提取物对肾脏组织中NF⁃κB、IκB、PI3K、AKT 蛋白表达的影响 由图2～5 可见，与假手术组比较，模型组中NF⁃κB、p⁃PI3K、p⁃AKT 蛋白表 达升高（P＜0.05），IκB 蛋白表达降低（P＜0.05）；与模型组比较，火绒草高、中剂量组中NF⁃κB、p⁃PI3K、p⁃AKT 蛋白表达均降低（P＜0.05），高、中、低剂量组IκB 蛋白表达均升高（P＜0.05）。

图2 火绒草水提物对NF⁃κB 蛋白表达的影响（n＝5）

4 讨论

肾脏疾病临床检测指标主要为血清肌酐和尿素氮，此项指标是了解肾功能的主要方法之一，血清肌酐和尿素氮升高意味着肾功能的损害。本实验中火绒草水提取物对大鼠MsPGN 模型中血清肌酐及尿素氮量的影响可初步评价火绒草对MsPGN 的治疗作用。

图3 火绒草水提物对IκB 蛋白表达的影响（n＝5）

系膜增生性肾小球肾炎发生时，沉积于肾小球系膜区的难溶性循环免疫复合物发生炎症反应，产生TNF⁃α 和IL⁃6，它们与系膜细胞表面的受体结合，进一步加重了炎症反应，进而引起肾小球损伤。因此抑制TNF⁃α 及IL⁃6 的释放对系膜增生性肾小球肾炎疾病的发生发展至关重要［8］。在本研究中，火绒草提取物可降低模型大鼠血清中TNF⁃α 和IL⁃6 水平，可推测火绒草通过抑制肾小球系膜区难溶性免疫复合物的沉积，减少了TNF⁃α 和IL⁃6 的释放。

图4 火绒草水提物对p⁃PI3K 蛋白表达的影响（n＝5）

图5 火绒草水提物对p⁃Akt 蛋白表达的影响（n＝5）

NF⁃κB 可调控免疫应答和炎症反应的基因转录、细胞的增殖和凋亡等多种细胞活动，IL⁃6、TNF⁃a 等炎症因子是NF⁃κB 的靶标基因，因此活化的NF⁃κB 在炎症反应过程中起到重要的作用。研究发现，抑制系膜细胞内的NF⁃κB 的活性，可改善MsPGN 中系膜细胞的功能异常［9］。PI3K 是信号转录途径中重要的调控蛋白，AKT 是PI3K 下游的磷酸化激酶，在细胞的生存和凋亡机制中起到重要的作用［10］。PI3K／AKT 信号通路与NF⁃κB 信号通路相互作用，紧密相连。活化后的AKT 可通过活化IκB 激酶（IKK）加速IκB 的降解及磷酸化p65 的Ser529 和Ser536 位点，增强已经结合在核内NF⁃κB 结合序列上的NF⁃κB 的转录活性，影响NF⁃κB 的核转位，进而影响系膜细胞的过度增殖。

本研究结果表明：模型组大鼠IκB 蛋白表达减少，NF⁃κB 的蛋白表达增加，PI3K／AKT 磷酸化水平增加，提示在MsPGN 模型大鼠肾脏中炎症NF⁃κB 信号转导通路和PI3K／AKT 信号转导通路被激活。药物干预5 周后，火绒草提取物可降低NF⁃κB 蛋白表达和PI3K／AKT 磷酸化表达，增加IκB 蛋白水平，提示火绒草提取物可能通过影响NF⁃κB 信号分子以及PI3K／AKT 信号分子的活化，进而抑制炎症因子的释放，从而缓解MsPGN 模型大鼠的肾脏病理损害，起到保护肾脏作用。