二岩虎果无糖颗粒HPLC 指纹图谱的建立

杨 宏刘永琴徐昌艳罗忠圣钱志瑶覃容贵*

（1.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳550025； 2.贵州医科大学天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳550014；3.贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳550025； 4.贵州医科大学公共卫生学院，贵州 贵阳550025）

二岩虎果汤为贵州医科大学附属医院名老中医饶天培的经验方，由石吊兰、岩白菜、虎杖、石仙桃4 味药材组成，主治风热内蕴、痰热犯肺所致咳嗽、哮喘，临床效果显著，应用多年未见不良反应，课题组计划将其开发为医院制剂，前期已完成拆方［1］、无糖颗粒制备工艺、部分质量标准［2］的研究。文献报道，二岩虎果汤君药石吊兰中石吊兰素［3］、臣药岩白菜中岩白菜素［4⁃5］、佐药虎杖中虎杖苷［6］和大黄素［7］等均为镇咳、抗炎有效成分，也是影响无糖颗粒药效的重要因素。化学识别模式包括主成分分析［8］、聚类分析［9］、偏最小二乘法判别分析［10⁃11］、灰色关联度分析［12］等方法，可对药物不同层面的信息进行深入分析［13］。本实验将建立二岩虎果无糖颗粒HPLC 指纹图谱，以期较全面地反映该制剂质量。

1 材料

1.1 药材 石吊兰、岩白菜、虎杖、石仙桃均购于贵州省万东桥药材市场，经贵州医科大学覃容贵教授鉴定为正品。经检验，石吊兰、岩白菜、虎杖质量均符合2015 年版《中国药典》 规定，石仙桃质量符合2003 年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》 规定。

1.2 颗粒 称取等份各药材，加入适量蒸馏水回流提取3次，合并提取液后浓缩，加入95%乙醇，4 ℃下放置24 h，弃去沉淀，醇沉液回收乙醇至无醇味，低温烘干后粉碎，得干膏粉。干膏粉、糊精、可溶性淀粉以1 ∶1.8 ∶0.2 的比例加80%乙醇制粒，烘干，整粒，即得二岩虎果无糖颗粒，其呈棕黄色至棕褐色，气香，味微苦，以铝塑复合袋分装，每袋装15 g，编号为S1（批号20180912）、S2（批号 20190311 ）、S3（批 号 20190201 ）、S4（批 号20190125）、S5（批号20190321）、S6（批号20190401）、S7（批号20190221）、S8（批 号20190412）、S9（批 号20181020）、S10（批号20180212）。

1.3 试剂 石吊兰素（批号111555⁃200602）、岩白菜素（批号111532⁃201604）、虎杖苷（批号111575⁃201603）、大黄素（批号110756⁃200110）对照品均由中国食品药品检定研究院提供。色谱纯甲醇（美国Tedia 公司）；分析纯甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；水为纯净水（深圳娃哈哈荣泰实业有限公司）。

1.4 仪器 ULtiMate 3000 型高效液相色谱仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；BT⁃25S 型电子天平（十万分之一，德国Sartorius 公司）；AS5051B 型超声波清洗仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters X⁃select C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）⁃水（B），梯度洗脱（0～10 min，10% A；10～20 min，10%～27% A；20～80 min，27%～70% A；80～90 min，70% A；90～100 min，70%～100%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长304 nm；进样量20 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取石吊兰素、岩白菜素、虎杖苷、大黄素对照品适量，加70%甲醇制成每1 mL 分别含四者0.025、0.35、0.048、0.015 mg 的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 取颗粒适量，研细，取细粉约1.0 g，精密称定，置于100 mL 锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷至室温，70%甲醇补足减失的质量，混匀，溶液过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同1 份供试品溶液（S4），在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，以3 号峰（虎杖苷）为参照峰（S），测得各共有峰相对保留时间RSD 小于0.4%，相对峰面积RSD 小于3%，相似度大于0.998，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同1 批颗粒（S4），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以3 号峰（虎杖苷）为参照峰（S），测得各共有峰相对保留时间RSD 小于1%，相对峰面积RSD 小于3%，相似度大于0.998，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同1 份供试品溶液（S4），于0、2、4、6、8、12、24、48 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，以3 号峰（虎杖苷）为参照峰（S），测得各共有峰相对保留时间RSD 小于3%，相对峰面积RSD 小于3%，相似度大于0.995，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.5 HPLC 指纹图谱建立

2.5.1 共有模式 取10 批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，采用中药指纹图谱相似度评价系统（2012 版），以S4 样品色谱图为参照，时间窗宽度0.4 min，中位数法生成对照图谱，多点矫正后作色谱峰匹配叠加，共确定15 个共有峰，指纹图谱见图1。

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱

2.5.2 共有峰 与对照品保留时间和紫外光谱继续比对后，指认了4 种成分，分别为3 号峰（岩白菜素）、5 号峰（虎杖苷）、12 号峰（石吊兰素）、13 号峰（大黄素），其中虎杖苷色谱峰分离度较好，峰面积最大，峰型稳定，所有样品均含有，故选择其作为参照峰（S），色谱图见图2。

图2 各成分HPLC 色谱图

2.5.3 相似度 应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）计算相似度，结果见表1，可知均大于0.900，表明各批样品具有较高相似性。再统计各批样品共有峰峰面积、相对保留时间及两者RSD，结果见表2，可知其RSD在18.48%～68.12% 范围内，表明各批样品质量具有较大差异。

表1 10 批样品相似度

表2 10 批样品共有峰信息

2.6 化学模式识别

2.6.1 聚类分析 将10 批样品共有峰峰面积导入SIMCA 14.1 软件进行聚类分析，结果见图3。由此可知，各批样品可分为3 类，其中Ⅰ类包括S2、S3、S5、S6、S8、S10，Ⅱ类包括S4、S7，Ⅲ类包括S1、S9。

图3 10 批样品聚类分析图

2.6.2 主成分分析 将10 批样品共有峰峰面积导入SIMCA 14.1 软件进行主成分分析，结果见表3，可知相关数据可降维成4 个主成分，其中前2 个贡献率最大，累积可达93.9%，故以其为坐标轴构建组主成分平面，将样品的多元变量通过降维方式投影在该平面上以观察其整体分布情况，结果见图4。由此可知，10 批样品可分为3 类，其中Ⅰ类在一、四象限比较集中，Ⅱ类分布在第三象限，与Ⅰ类距离较近；Ⅲ类分布在第二象限，与其他样品距离较远，与“2.6.1”项下聚类分析结果一致。主成分分析载荷图可表示每个色谱峰对主成分的综合贡献，通过测量色谱峰投影点到坐标轴原点的距离来表达该色谱峰对样本分类的整体影响［14］，发现1 号、2 号、3 号（岩白菜素）、5 号（虎杖苷）、7 号、8 号、10 号、12 号（石吊兰素）、13 号（大黄素）色谱峰的影响较大，见图5。

图4 10 批样品主成分散点得分图

图5 10 批样品主成分载荷图

表3 主成分分析特征值及累积方差贡献率

2.6.3 偏最小二乘法判别分析 将10 批样品共有峰峰面积导入SIMCA 14.1 软件进行有监督的偏最小二乘法判别分析（PLS⁃DA），结果见图6，可知主成分回归系数Q2为0.773，矩阵结实程度R2X为0.937，型区分参数R2Y为0.894，均大于0.5，表明该模型对样品的区分程度和预测能力较强。变量重要性投影值（VIP）可反映色谱峰贡献程度［14］，以VIP＞1 为标准，12 号（石吊兰素）、7 号、3号（岩白菜素）、1 号、5 号（虎杖苷）、13 号（大黄素）色谱峰可能是导致不同批次样品差异的主要标志物，见图7，与“2.6.2”项下主成分分析载荷图的重要性权重大体一致，取两者交集后按VIP 值排序，依次为12 号（石吊兰素）、7 号（未知化合物1）、3 号（岩白菜素）、1 号（未知化合物2）、5 号（虎杖苷）、13 号（大黄素）色谱峰，是3 种类型样品之间产生差异的重要成分，提示仅测定石吊兰素含量无法全面描述颗粒质量，在今后研究和生产中应重点关注上述6 种成分含量的变化。

图6 10 批样品PLS⁃DA 散点得分图

图7 10 批样品色谱峰VIP 图

3 讨论与结论

本实验考察了不同溶剂及比例（55%甲醇、70%甲醇、甲醇、55%乙醇、70% 乙醇、乙醇）、提取时间（15、30、45 min）的效果，发现70%甲醇超声提取30 min 时色谱峰最多，峰型较好，能在较大程度上反应二岩虎果无糖颗粒成分信息。再采用DAD 检测器采集190～400 nm 波长下的紫外色谱图，通过观察3D 图谱选择了215、304、335 nm，发现304 nm 下色谱峰响应良好，检出数量最多，而且基线稳定，峰面积适中，故确定304 nm 作为检测波长。

采用聚类分析、主成分分析、偏最小二乘法判别分析对10 批二岩虎果无糖颗粒HPLC 指纹图谱进行化学模式识别，建立样品分类模型。结果显示，各批样品HPLC 指纹图谱形貌基本一致，但成分含量不尽相同，可能与药材产地、炮制方法、采收季节、储藏条件、生产规模等因素有关；所有样品分为3 类；石吊兰素、未知化合物1、岩白菜素、未知化合物2、虎杖苷、大黄素是主要差异标志物，可作为质量控制成分来综合反映其质量的整体性和特征性。

综上所述，本实验建立了二岩虎果无糖颗粒HPLC 指纹图谱，该方法灵敏度高，分离度好，信息丰富，特征性强，能全面系统的反映该制剂质量，以期为其深入研究开发提供参考依据。