基于多元统计分析和多指标评价假东风草和东风草的质量

苏宏娜李学学农常东李修善李文兵刘 圆

（1.西南民族大学药学院，四川 成都610041； 2.四川省羌彝药用资源保护与利用技术工程实验室，四川成都610225； 3.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都610041； 4.西南民族大学民族医药研究院，四川 成都610041； 5.广西万寿堂药业有限公司，广西 南宁530000）

滇桂艾纳香为广西壮瑶彝传统使用药材，具有活络经血、祛风除湿、止血、利尿等功效，用于治疗经期不准、产后大出血、不孕症、阴疮、风湿骨痛等症［1⁃3］，在广西尤其是在百色地区有较长的使用历史。研究发现［4⁃7］滇桂艾纳香主要含有黄酮类、甾醇类、多糖类及水溶性活性成分等。药理实验证明［4⁃5，8⁃10］，滇桂艾纳香有增强子宫收缩、促凝血、镇痛、抗炎、保护肝脏等作用。

广西省药材标准、湖南省中药材标准［11］仅收载假东风草Blumea riparia（Bl.）DC.作为滇桂艾纳香药材来源。但课题组前期文献［1，3，12⁃13］考证和实地走访调研、多次采集原植物花期、果期发现，滇桂艾纳香药材在壮瑶医临床使用、壮瑶草药材市场有“小花种”“大花种”2 种，制药企业生产中滇桂艾纳香生产投料中的假东风草Blumea riparia（Bl.）DC.（小花种，地标收载品种）。课题组开展了进行原植物鉴别，确定“小花种”为菊科艾纳香属植物假东风草的干燥全草，又名滇桂艾纳香［1］；大花种为菊科艾纳香属植物东风草Blumea megacephala（Randeria）Chang et Tseng 的干燥全草，又名白花九里明、管芽［3］等，对风湿骨痛、跌打肿痛、产后血崩、月经不调有一定的疗效［14⁃15］。目前，国内对东风草（大花种，非标品种）是否能作为滇桂艾纳香药材来源等同入药的相关研究较少［13⁃14］。因此，本研究拟对东风草与假东风草开展药材质量比较，结合课题组其他研究结果，为确认东风草是否能够纳入滇桂艾纳香的一个新的植物基原同等入药提供参考。

1 材料

LC⁃7030C 3D 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；TU⁃1810 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ⁃259DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AE240 电子分析天平（瑞士梅特勒⁃托利多公司）；DHG⁃9240A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SX2 型箱式电阻炉（长沙市远东电炉厂）；HH⁃2 型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

芦丁对照品（批号100080⁃200707，纯度≥98%）购于中国食品药品检定研究院；3，4⁃二咖啡酰奎宁酸（批号17121201）、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸（批号19061201）对照品均购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度均大于98%。乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，北京迪马科技有限公司）；甲醇、盐酸、乙醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；水为屈臣氏蒸馏水。药材由课题组采自广西省百色市、南宁市，经西南民族大学刘圆教授、李莹副教授鉴定为菊科艾纳香属植物假东风草Blumea riparia（Bl.）DC.（小花种，地标收载品种）、菊科艾纳香属植物东风草Blumea megacephala（Randeria）Chang et Tseng（大花种，非标品种），信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 水分、总灰分、酸不溶性灰分测定 按2020年版《中国药典》 四部［15］方法，对水分（通则0832）、总灰分（通则2302）、酸不溶性灰分（通则2302）进行测定。

2.2 醇溶性浸出物测定 以40%乙醇为溶剂，按2020 年版《中国药典》 四部［15］（通则2201）醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定。

2.3 总黄酮含量 参考文献［16］ 中响应面优化的条件、方法，测定样品中总黄酮含量。

2.3.1 对照品溶液制备 取芦丁对照品适量，精密称定质量，40%乙醇定容至10 mL，摇匀，得质量浓度为1 mg／mL 的母液。分别精密量取0、0.1、0.2、0.5、0.8、1 mL，加0.3 mL 5% NaNO2溶液，混匀，静置6 min，加0.3 mL 10% Al（NO3）2混匀，静置6 min，再加4 mL NaOH 试液，40%乙醇稀释至10 mL，摇匀，制成质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.08、0.1 mg／mL 的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液制备 取待测样品0.2 g，精密称定质量，置于具塞锥形瓶中，精密加入20 mL 40%乙醇，密塞，称定质量，超声（600 W、40 kHz）处理30 min，放冷，40% 乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精确量取0.1 mL 滤液，加0.3 mL 5%NaNO2溶液，混匀，静置6 min，加0.3 mL 10%Al（NO3）2混匀，静置6 min，再加4 mL NaOH 试液，40%乙醇稀释至10 mL，摇匀，即得。

2.3.3 线性关系考察 取对照品溶液，在500 nm波长下测定吸光度。以质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝12.184X－0.017 6（r＝0.999 8），在10～100 μg／mL范围内线性关系良好。

2.3.4 精密度试验 取适量“2.3.1”项下对照品溶液，连续测定6 次吸光度。结果，吸光度RSD为0.86%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批样品（D10）6 份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，测定吸光度。结果，吸光度RSD 为1.43%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验 取“2.3.2”项下对照品溶液，分别在0、10、20、40、60 min 测定吸光度。结果，吸光度RSD 为0.91%，表明供试品溶液于制备后1 h 内稳定性良好。

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相［乙腈⁃甲醇（1 ∶1）］ ⁃0.1% 甲 酸；体积流 量1.0 mL／min；检测波 长327 nm；柱温30 ℃。3，4⁃二咖啡酰奎宁酸、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸与样品中其他组分色谱峰达基线分离，其理论塔板数均大于5 000，见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 对照品溶液制备 取3，4⁃二咖啡酰奎宁酸、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸对照品适量，精密称定质量，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇溶解并稀释至刻度（质量浓度分别为1.028、0.992 mg／mL），70%甲醇稀释，得到3，4⁃二咖啡酰奎宁酸质量浓度分别为0.010 0、0.020 1、0.051 4、0.082 2、0.102 8 mg／mL，3，5⁃二咖啡 酰奎宁 酸质量 浓度分别为0.001 0、0.019 8、0.049 6、0.079 4、0.099 2 mg／mL的对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液制备 取样品约0.2 g，精密称定质量，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇，密塞，称定质量，超声（600 W、40 kHz）处理30 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 线性关系考察 准确吸取适量对照品溶液，70%甲醇稀释成不同质量浓度，在“2.4.1”项色谱条件下进样。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.5 精密度试验 取适量“2.4.2”项下对照品溶液，在“2.4.1”项色谱下连续进样6 次。结果，3，4⁃二咖啡酰奎宁酸、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸峰面积RSD 分别为0.56%、0.52%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 重复性试验 取同一批样品（D10）6 份，按“2.4.3”项下方 法制备 供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下测定，测得3，4⁃二咖啡酰奎宁酸含量RSD 为1.67%，3，5⁃二咖啡酰奎宁酸含量RSD 为1.93%，表明该方法重复性良好。

2.4.7 稳定性试验 取“2.4.2”项下对照品溶液，于0、6、12、18、24 h 在“2.4.1”项色谱条件下进样，测得3，4⁃二咖啡酰奎宁酸、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸含量RSD 分别为0.52%、0.49%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.8 加样回收率试验 取同一批样品（D12），按“2.4.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按1 ∶1 的比例加入3，4⁃二咖啡酰奎宁酸、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸，测得两者平均加样回收率分别为101.63%、99.23%，RSD 分别为3.82%、2.01%。

3 结果与分析

3.1 测定结果 由表3 可知，9 批假东风草水分含量最高为9.98%，最低为7.83%，平均值为9.21%，均符合2009 年版 《湖南省中药材标准》［17］不得超过14.0%的规定；9 批假东风草总灰分含量最高为8.88%，最低为4.94%，平均值为6.50%；酸不溶性灰分含量最高为1.23%，最低为0.57%，平均值为0.87%；浸出物含量最高为27.08%，最低为17.61%，平均值为22.21%。10批东风草水分含量最高为9.67%，最低为6.24%，平均值为8.00%；总灰分含量最高为10.68%，最低为6.52%，平均值为8.90%；酸不溶性灰分含量最高为1.73%，最低为0.79%，平均值为1.21%；浸出物含量最高为17.77%，最低为10.57%，平均值为13.56%。

表3 假东风草和东风草测定结果Tab.3 Determination results of B.riparia and B.megacephala

9 批假东风草总黄酮平均含量为126.10 mg／g，10 批东风草其平均含量为82.65 mg／g。9 批假东风草中3，4⁃二咖啡酰奎宁酸、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸平均含量分别为7.80、4.18 mg／g，10 批东风草两者平均含量分别为3.52、4.43 mg／g。

3.2 聚类分析 采用SPSS 20.0 软件对9 批假东风草和10 批东风草水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、总黄酮、3，4⁃二咖啡酰奎宁酸、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸含量测定结果进行系统聚类分析，结果见图2。由此可知，以水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、总黄酮、3，4⁃二咖啡酰奎宁酸和3，5⁃二咖啡酰奎宁酸为指标，可将假东风草和东风草聚为两类，其中D2～D3、D7～D8、D10～D14、D16～D19 聚为一 类，D1、D4～D6、D9、D15 聚为另一类，但未能将2 个物种明显区分开。

图2 9 批假东风草、10 批东风草树状图Fig.2 Dendrogram of nine batches of B.riparia and ten batches of B.megacephala

3.3 主成分分析 采用SPSS 20.0 软件对9 批假东风草和10 批东风草水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、总黄酮、3，4⁃二咖啡酰奎宁酸、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸含量测定结果进行主成分分析，结果见图3。以特征值（n）≥1 为原则提取2 个主成分，累积贡献率达到71.93%，可说明7 种成分的变化趋势，从而客观反映假东风草和东风草信息。浸出物、总黄酮和3，5⁃二咖啡酰奎宁酸在第1 主成分中有较高载荷，可反映这3 种成分的信息，呈高度正相关；3，4⁃二咖啡酰奎宁酸在第2主成分中有较高载荷，可反映这1 种成分的信息，呈高度正相关。根据提取的2 种主成分得分对19批样品进行分析，发现可将D5、D9、D12、D14、D16、D18～D19 分为一 类，D1～D4、D6～D8、D10～D11、D13、D17 分为另一类，但也未能将假东风草、东风草2 个品种明显区分开，与聚类分析结果基本一致。

图3 24 批样品主成分分析图Fig.3 Principal component analysis plot for twenty⁃four batches of samples

4 讨论与结论

9 批假东风草和10 批东风草水分、灰分和浸出物含量最高值与最低值之间有较大差异，表明不同产地假东风草和东风草种间和种内质量均有差异；假东风草总黄酮含量高于东风草；假东风草中3，4⁃二咖啡酰奎宁酸的含量高于3，5⁃二咖啡酰奎宁酸，且3，4⁃二咖啡酰奎宁酸含量高于东风草；东风草中3，5⁃二咖啡酰奎宁酸含量高于3，4⁃二咖啡酰奎宁酸，且高于假东风草中3，5⁃二咖啡酰奎宁酸含量。多指标系统聚类分析和主成分分析结果并未将东风草和假东风草2 个品种明显区分开。

3，4⁃二咖啡酰奎宁酸和3，5⁃二咖啡酰奎宁酸是一类广泛存在于金银花、苍耳等中药材中的二咖啡酰奎宁酸类［17⁃18］。据文献报道［17⁃20］，该类成分具有抗氧化、抗炎、抗血小板活性物质等作用；课题组前期针对这2 种植物的化学成分分离研究中，提取分离出3，4⁃二咖啡酰奎宁酸和3，5⁃二咖啡酰奎宁酸，故选用该2 种成分与药材功效相关且在植物中含量较高、容易得到的成分作为质量指标性成分。

根据本实验结果，基于东风草的总黄酮、3，4⁃二咖啡酰奎宁酸、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸含量较高，药材市场、广西百色市和南宁市壮瑶彝等民族民间临床长期混用、新资源发现的实际情况，结合课题组其他研究结果综合考虑，建议对东风草与假东风草开展临床功效对应的药效学比较研究，将东风草纳入滇桂艾纳香的一个新的植物基原同等入药；滇桂艾纳香药材项下，规定水分不超过14%，总灰分不超过11.00%，酸不溶性灰分不超过1.50%，浸出物不低于11.00%，总黄酮含量不低于67.00 mg／g，3，4⁃二咖啡酰奎宁酸含量不低于2.80 mg／g，3，5⁃二咖啡 酰奎宁 酸含量不低于3.50 mg／g。