Cldn4抑制胰腺癌的迁移

王申森，刘馨慧，黄 华，李 欢，王 娟

(北京工业大学环境与生命学部，北京 100124)

胰腺癌是最常见的胰腺肿瘤，主要起源于胰腺导管上皮及腺泡细胞的细胞恶性转变，因为其发病率和死亡率都高居全球恶性肿瘤前十位并且是预后最差的恶性肿瘤之一，所以被称为“癌中之王”. 因此，对胰腺癌发生及发展过程的研究具有极为重要的科研及临床意义.

Claudin 4(Cldn4)是一种紧密连接蛋白，是Claudin家族的一员，Claudin蛋白均由4个跨膜结构域构成，N端和C端均位于细胞内部，细胞膜外有2个长度不等的环，可以和临近其他同类型的环相接触构成细胞间的紧密连接[1-3]. 而且Cldn4的结构高度保守，从线虫到人类都十分相似. 当Claudin蛋白发生变化时将影响细胞间的通透性进一步引起多种疾病的发生[4-6].

目前已报道Cldn4在卵巢癌[7-9]、前列腺癌[10-11]、乳腺癌[12-13]、胰腺癌[14]、肠道癌等[15]多种肿瘤中表达上调[16]，并且作为一种癌基因介导癌症的发生，但是在胰腺癌中将作为一种抑癌基因还是癌基因仍有争议：Michl等[17]研究表明Cldn4能够降低胰腺癌细胞SUIT-2的侵袭和转移能力，而Kumei等[18]研究表明使用罗格列酮可以通过抑制 MEK-ERK 信号通路增加Cldn4的表达，从而降低了胰腺癌细胞的侵袭力. 本文将通过对胰腺癌细胞PANC-1进行研究进一步确定Cldn4对胰腺癌细胞迁移能力的影响.

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胰腺癌细胞PANC-1和293T细胞购自中国科学院细胞库；Cldn4抗体购自abcom；MTT试剂盒购自索莱宝；DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；cDNA反转录试剂盒、Real time PCR 试剂盒、qPCR引物序列购自北京擎科新业生物技术有限公司；PVDF膜、ECL发光液购自美国Millipore公司；Transwell小室购自Corning；细胞裂解及蛋白抽提试剂、BCA蛋白浓度检测试剂盒、Western blot配胶试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司.

1.2 细胞增殖检测

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔150 μL，2 000个细胞/孔. 置37 ℃、5% CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6～24 h. 小心吸去上清，加入90 μL新鲜培养液，再加入10 μL MTT溶液，继续培养4 h. 然后吸掉上清，每孔加入110 μL Formazan溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解. 在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值. 同时设置调零孔(培养基、MTT、Formazan溶解液)，每组设定3复孔.

1.3 克隆形成实验

取对数生长期细胞，PBS清洗，胰酶消化，加DMEM完全培养基进行吹打重悬，制成单细胞悬液. 血球计数板计数，根据细胞增殖能力，在六孔板中，对照组和实验组分别铺入200个细胞，于细胞培养箱内静置培养2周. 当培养板出现肉眼可见的克隆时，终止实验，4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.1%结晶紫染色20 min,清水洗净染色液. 干燥克隆培养板，拍照，记录实验结果.

1.4 细胞划痕实验

在超净工作台内对实验所用到的马克笔、直尺、所用器材等进行紫外照射灭菌30 min. 铺细胞前用马克笔在六孔板外底部每隔0.5 cm画一条线，每个孔划4条线，在板中铺约5×105个细胞，使细胞第2天能铺满整个孔面. 根据孔板外底部的线进行划线，枪头要直，不能倾斜，避免划得粗细不均，PBS清洗划下的细胞，沿壁轻轻加入完全培养基，细胞培养箱中培养. 按0、24、48 h的时间点显微镜下拍照. 每次都要在同一固定观察点观察划痕愈合情况. 用Image J软件测量划痕区域长度，计算细胞迁移能力. 计算公式：划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%.

1.5 Transwell实验

选取处于对数生长期的细胞，即细胞密度达到80%～90%时，PBS清洗2～3遍，胰酶消化3 min左右(根据细胞的贴壁能力)，加DMEM完全培养基进行吹打，800 r/min离心细胞. 离心细胞后，弃去培养基，PBS清洗1～2次，加入无血清培养基，重悬细胞，吸取1 mL细胞悬液再加入无血清培养基进行稀释，血球计数板进行细胞计数,调整细胞密度为104/mL. 将Transwell小室置于24 孔板中，上室加入200 μL的细胞悬液，下室加入含10%FBS的DMEM培养基600 μL. 在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养24～48 h. 将24孔板从培养箱中取出，用移液器吸取上室的培养基，PBS溶液清洗小室2次，棉签擦去上室细胞，室温4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.1%结晶紫染色15 min，清洗. 倒置显微镜下观察穿过小室的细胞量. 随机选择5个视野进行拍照、计数取平均数.

1.6 Real-Time PCR检测

将细胞融合度在80%左右的各组细胞处理后使用TRIzol提取RNA，使用cDNA反转录试剂盒反转录cDNA,以β-Actin为内参进行qPCR，引物如下：Cldn4-F：ATGCAGTGCAAGGTGTACGA，Cldn4-R：GACACCGGCACTATCACCAT；β-Actin-F：TGACG TGGACATCCGCAAAG，β-Actin-R：CTGGAAGGTG GACAGCGAGG. 结果使用2-ΔΔCt相对定量法计算mRNA表达水平.

1.7 Western blot

将细胞融合度在80%左右的各组细胞处理后使用含PMSF的RIPA裂解液提取总蛋白，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，加入5×SDS上样缓冲液和RIPA将蛋白定量，沸水浴10 min变性，上样后进行SDS-PAGE电泳(浓缩胶80 V 30 min ，分离胶120 V 1.5 h)并转膜(90 V恒压湿转1 h)到PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加一抗(1∶1 000)4 ℃孵育12 h，使用对应二抗孵育后进行显影.

1.8 病毒包装与感染

将293T细胞铺于10 cm皿中待细胞生长到70%左右使用转染试剂将穿梭质粒和包装质粒按照一定比例共转染到细胞中，12 h后进行换液. 分别在转染后48 h和72 h收取细胞培养液加入5×PEG8000在4 ℃冰箱中放置2 h，其间摇匀2～3次. 3 000 r/min离心30 min，弃上清后使用DMEM重悬病毒沉淀分装后放置于-80 ℃冰箱备用. 将PANC-1细胞铺于6孔板中，待细胞生长到70%左右加入对应的病毒感染细胞，6 h后换液，48 h后加入对应的抗生素筛选细胞.

1.9 细胞的构建

为了构建过表达Cldn4的细胞系，使用引物F：gtgaccggcgcctactctagaATGGCCTCCATGGGGCTACA GG和引物R：gccctcagcggccgcggatccTTACACGTA GTTGC TGGCAGCAGC以人源cDNA为模板将Cldn4的开放阅读框调取出，并同源重组至慢病毒载体pCDH-EF1α-MCS-T2A-puro. 在293T细胞中包毒后感染PANC-1细胞，使用2 μg/mL的嘌呤霉素筛选出阳性细胞.

为了构建敲低Cldn4的细胞系(shCldn4)，使用引物F：gatcGCTTTGTTCTTCCCTGGACTGTCAAGA GCAGTCCAGGGAAGAACAAAGCttttt和R：aattAAA AAGCTTTGTTCTTCCCTGGACTGCTCTTGACAGTCCA GGGAAGAACAAAGC退火形成双链后，并连接组至慢病毒载体pLVX-shRNA2-Puro. 在293T细胞中包毒后感染PANC-1细胞，使用2 μg/mL的嘌呤霉素筛选出阳性细胞.

1.10 统计学处理

采用Origin软件进行数据统计与作图，多因素方差分析采用Bonferroni post-tests方法进行，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示. 所得数据进行正态分布检验，组间比较采用t检验与单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义. 其中*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2 结果与分析

2.1 Cldn4在肿瘤中表达量异常

通过TCGA数据库的搜索发现，Cldn4在肿瘤中mRNA的表达量显著性高于正常组织中的表达量(如图1所示，T代表tumor，N代表normal)，与Michl等[17]文献中报道的结果相同：在胰腺癌中Cldn4表达量异常上升. 这表明Cldn4在肿瘤的发生和发展过程中可能存在一定的作用.

图1 Cldn4在胰腺癌和正常组织中的表达量Fig.1 Expression of Cldn4 in pancreatic cancer and normal tissue

2.2 胰腺癌细胞系中Cldn4的表达量

通过qPCR和Western blot检测胰腺癌PANC-1细胞中经过慢病毒稳定过表达和敲低Cldn4后Cldn4的mRNA和蛋白水平. 过表达Cldn4后Cldn4在mRNA水平和蛋白水平均有显著性差异(如图2(a)和图2(b)右图所示)；敲低Cldn4后Cldn4在mRNA水平和蛋白水平均有显著性差异(如图2(a)和图2(b)左图所示).

图2 PANC-1细胞中过表达和敲低Cldn4后mRNA和蛋白的表达水平Fig.2 Expression levels of Cldn4 mRNA and protein in PANC-1 cells after overexpress and knockdown Cldn4

2.3 Cldn4不影响细胞的增殖

分别将胰腺癌PANC-1细胞中稳定过表达和敲低Cldn4的细胞同对照组细胞等量铺于96孔板中，取0、24、48、72、96 h的细胞使用MTT试剂盒进行检测. 无论过表达还是敲低Cldn4均对胰腺癌细胞PANC-1的增殖没有显著性影响，如图3所示. 本结果表明Cldn4并不影响胰腺癌细胞的增殖能力.

图3 过表达和敲低Cldn4后对PANC-1细胞增殖能力的影响Fig.3 Effect of Cldn4 overexpression and knockdown on proliferation of PANC-1 cells

2.4 Cldn4抑制细胞的迁移能力

分别将胰腺癌PANC-1细胞中稳定过表达或敲低Cldn4的细胞同对应对照组细胞铺于24孔板中，待细胞贴壁后进行划痕并拍照，每24 h进行拍照观察. 过表达Cldn4与对照组对比结果显示过表达Cldn4后能够抑制胰腺癌细胞划痕愈合的速度(如图4(a)(c)左侧图所示)；敲低Cldn4与对照组对比结果显示降低Cldn4的表达后能够促进胰腺癌细胞划痕愈合的速度(如图4(b)(c)右侧图所示)，结果如图4所示.

图4 过表达和敲低Cldn4后对PANC-1细胞迁移能力的影响Fig.4 Effect of Cldn4 overexpression and knockdown on migration of PANC-1 cells

另一种方法使用Transwell细胞迁移实验验证Cldn4对胰腺癌细胞迁移的影响. 过表达Cldn4与对照组对比结果显示Cldn4表达量上升后能够抑制胰腺癌细胞穿过Transwell小室的能力(如图5(a)(c)左图所示)；敲低Cldn4与对照组对比结果显示降低Cldn4的表达后能够促进胰腺癌细胞穿过Transwell小室的能力(如图5(b)(c)右图所示). 以上结果证明Cldn4能有效抑制胰腺癌细胞的迁移能力. 结果如图5所示.

图5 过表达和敲低Cldn4后对PANC-1细胞迁移能力的影响Fig.5 Effect of Cldn4 overexpression and knockdown on migration of PANC-1 cells

3 讨论

Cldn4是Claudins蛋白家族的一员，并且是细胞黏附结构的重要连接蛋白之一. 有假说认为在肿瘤代谢中Claudins的降低能够加强肿瘤的转移和入侵；另一方面有的研究表明Claudins的过量表达能够导致肿瘤中蛋白的定位和功能异常，进而促进肿瘤的转移和入侵. 目前研究发现Cldn4在多种肿瘤中表达量异常升高，且在卵巢癌、肠道癌、乳腺癌等癌症中被证明作为一种癌基因促进肿瘤的发生；而在胃癌中发现Cldn4扮演着抑癌基因的角色[19]. 文献报道证明和数据库均显示Cldn4在胰腺癌中异常表达升高，提示Cldn4在胰腺癌发生发展过程中可能扮演着重要的角色，但是在胰腺癌中Cldn4的功能并不明确.

为探讨Cldn4在胰腺癌中的作用，本实验使用慢病毒的方法构建了稳定过表达Cldn4和稳定敲低Cldn4的PANC-1细胞系，并通过qPCR和Werstern blot检测Cldn4的表达水平变化. 本文通过细胞增殖检测实验发现，Cldn4并不影响胰腺癌细胞的增殖，但是通过细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验证明Cldn4能够抑制胰腺癌细胞迁移，这表明Cldn4在胰腺癌细胞中可能扮演着抑癌基因的角色，但其具体的分子调控机制并未阐述. 综合Cldn4的文献报道和最新的研究，猜测其在胰腺癌中的抑癌机制可能与乳腺癌中报道的相关通路PAK4-CEBPB-Cldn4有关[20]；或者与胃癌中报道的PI3K/Akt 途径有关[19]. 而Cldn4表达量的变化可能与之前报道过的基因的甲基化改变有关[21]，或者非编码RNA能够控制Cldn4的表达[22].

Cldn4在很多肿瘤中异常表达，已经有文献报道将Cldn4作为治疗肿瘤的特定靶点. Cldn4是产气荚膜梭菌肠毒素(clostridium perfringens enterotoxin，CPE) 的受体，CPE结合Cldn4后可通过胞膜穿透作用使细胞溶解坏死. Michl等[14]用CPE瘤内注射异种嫁接的胰腺癌细胞，引起肿瘤细胞的大面积死亡，延缓肿瘤的生长. 在前列腺癌细胞和高表达Cldn4的肿瘤中也报道过CPE有治疗效果[23-24]. 目前也有研究证明CAR-T对部分Claudins有一定的作用，希望后期能够研究出针对Claudins的CAR-T细胞疗法[25].

Cldn4作为十分常见的肿瘤异常表达基因，对于其研究仍处于初步阶段，仍需要对其调节机制进行进一步的了解和报道，这对于了解肿瘤的发生发展有着极为重要的理论和实践意义.

4 结论

1) Cldn4在胰腺癌中异常高表达.

2) Cldn4能够显著抑制胰腺癌细胞PANC-1的迁移能力.

3) Cldn4对胰腺癌细胞PANC-1的增殖能力无显著影响.