一起不明原因腹泻疫情的病原学研究

蒋靖怡，毛旭建，江锦宜，李 琼，杜 强，姚 萍

（常州市疾病预防控制中心，江苏 常州 213022）

感染性腹泻是一组由多因素、多病原体引起的肠道传染病，在发达国家和发展中国家都是主要感染性疾病之一[1]。其他感染性腹泻是指除霍乱、痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻，是由细菌、病毒、寄生虫等引起的肠道感染，在我国被列为丙类传染病，是我国重要的公共卫生问题之一[2]。引起其他感染性腹泻的常见病原体主要有细菌（副溶性弧菌、大肠杆菌、沙门菌、志贺菌等）、病毒（轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒等）、寄生虫（隐孢子虫、环孢子虫、兰伯氏贾第鞭毛虫等）[3-5]。

2020 年年底，常州市某学校发生一起不明原因感染性腹泻疫情，主要症状为恶心、呕吐、腹痛、腹泻，个别伴发热。12月22日起陆续有学生发病，截至2021年1月4日，共出现100多例呕吐、腹泻病例。为检测引起此次不明原因腹泻的病原体，有针对性地控制疫情的传播，我们将采集的样本做了以下一系列检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测样本：依据感染性腹泻诊断标准，于2020年12月27日采集腹泻病例肛拭子10 份，2021年1月3日采集新发腹泻病例肛拭子8 份。两批共计18 份检测样本，均冷藏运输待检。

1.1.2 实验仪器：低温高速离心机（Thermo Scientific），Prism® 7500型实时定量PCR仪（Applied Biosystems），全自动核酸提取仪（Applied Biosystems），微型电泳转移槽（Bio-Rad），BioFire FilmArray（BioMerieux），ChemiDoc XRS+成像仪（Bio-Rad）。

1.1.3 主要试剂：核酸提取试剂盒（重庆中元生物技术有限公司），达安基因股份有限公司的肠道病毒通用型核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），上海之江生物技术有限公司的腹泻类病毒核酸测定试剂盒（荧光PCR法-96孔预装板），FilmArray GI Panal胃肠道感染测试试剂盒，江苏硕世生物科技有限公司的肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E.coli,EHEC）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）。

1.2 检测方法

1.2.1 病毒核酸提取与实时荧光定量PCR：采用自动化核酸提取仪与磁珠法核酸提取试剂盒，吸取50 μL待测样品加入含磁珠的溶液中，选择自动化程序开始提取，最后核酸溶于50 μL洗脱液中，并于－80 ℃长期保存。

病毒核酸荧光定量PCR检测试剂为达安基因股份有限公司的肠道病毒通用型核酸检测试剂盒，荧光检测通道为FAM通道；上海之江生物技术有限公司的腹泻类病毒核酸测定试剂盒（96孔预装板），可以分别定性检测8 种腹泻类病毒的特异性核酸片段：肠道腺病毒、轮状病毒A组、轮状病毒B组、轮状病毒C组、诺如病毒Ⅰ型、诺如病毒Ⅱ型、札如病毒、人星状病毒，荧光检测通道为FAM通道。荧光定量PCR反应在ABI 7500定量PCR仪上进行，其扩增程序为逆转录45 ℃ 10 min；预变性95℃ 15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40 个循环，反应体系为25 μL。

细菌核酸荧光定量PCR检测试剂为EHEC核酸检测试剂盒，荧光素FAM标记靶基因STX1、荧光素VIC标记靶基因STX2、荧光素ROX标记靶基因eae，其扩增程序为预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃10 s，退火延伸及荧光检测55 ℃ 40 s，共40 个循环，反应体系为25 μL。

1.2.2 FilmArray多重PCR：FilmArray GI Panal胃肠道感染测试试剂盒可以同时检测引发腹泻的22 种病毒、细菌和寄生虫。该仪器将样本核酸的制备、扩增、检测和分析过程整合于一体。FilmArray测试条中包含核酸提取、逆转录、PCR和检测过程中所需的所有干粉试剂。仪器运行前，在测试条两段分别加入试剂缓冲液和样本混合液。其余步骤全部由FilmArray仪器自动完成：①从样本中提取并纯化核酸；②完成第一阶段多重PCR，初步扩增DNA片段；③在第一阶段PCR扩增产物的基础上，完成第二阶段巢式PCR；④利用溶解曲线分析数据，生成结果分析报告。

2 结果

2.1 引起腹泻的常见病毒荧光定量PCR检测结果 由于此次腹泻疫情传播人数较多，传播时间快，因此我们首先怀疑是由病毒引起的腹泻疫情。在用腹泻类病毒核酸测定试剂盒（96孔预装板）进行荧光定量PCR检测后，发现肠道腺病毒、轮状病毒A组、轮状病毒B组、轮状病毒C组、诺如病毒Ⅰ型、诺如病毒Ⅱ型、札如病毒、人星状病毒均为阴性，我们又使用肠道病毒通用型核酸检测试剂盒进行荧光定量PCR检测，检测结果同样为阴性。

2.2 FilmArray多重PCR检测结果 通过荧光定量PCR检测发现，引起腹泻的常见病毒核酸检测结果均为阴性。为了快速高效地寻找引起此次腹泻疫情的病原微生物，我们选择FilmArray多重PCR检测方法，并采用配套的胃肠道感染测定试剂盒。该试剂盒可同时检测22 种病原体靶标，涵盖了细菌、寄生虫与病毒。我们随机挑取了10 个样本进行检测，由于此方法检测灵敏度较高，因此我们将每3 个样本混合进行检测，结果显示，有一组样本显示产志贺样毒素大肠埃希菌（Shiga-like toxin-producing E.coli, STEC）阳性。另外，腺病毒、星状病毒、诺如病毒GⅠ/GⅡ、轮状病毒A群、札如病毒均未检测到，也验证了之前荧光定量PCR的结果。

2.3 荧光定量PCR验证结果 FilmArray多重PCR检测结果为我们提供了思路，这起疫情很有可能是由STEC引起。然而，为了节约成本，FilmArray只检测了随机抽取的10 份样本，且是每3 个样本混合为一个样本进行检测，如果这仅仅是个例，不能说明STEC是引起此次腹泻疫情的病原，所以我们应用荧光定量PCR的方法确定所有样本中到底哪几例是STEC阳性。检测结果表明，所有18 例肛拭子样本中，5 例检测出EHEC的毒力因子Stx1/eae（图1）。

图1 EHEC核酸检测试剂盒进行荧光定量PCR检测

EHEC属于致泻性大肠埃希菌，是引起小儿与成人腹泻的主要致病菌[6]。食用不洁食物后，EHEC进入大肠，借助外膜蛋白的黏附能力，黏附至回肠末端、盲肠和结肠，产生志贺样毒素（Shiga-like-toxin, SLT），其中SLT-1除1个氨基酸外，其余均与志贺毒素相同；SLT-2则有60%与志贺毒素同源，故EHEC也称为STEC。

EHEC的致病因子主要为前噬菌体编码的志贺毒素Stx[7]，Stx家族成员有Stx1和Stx2，两者在免疫学上没有交叉反应，一个EHEC菌株可以只表达两者其一，也可以同时表达[8]。eae基因编码一种紧密素，当EHEC要入侵人体时，通过紧密素黏附在肠黏膜上，从而防止因肠蠕动而将其排出，因此eae基因也是STEC致病的关键因子[9]。

此次疫情检测到的STEC同时表达Stx1与eae基因，Stx2基因未检出。

3 讨论

此次腹泻疫情所采集样本均为病人的肛拭子样本，进行核酸提取后，先采用常规的荧光定量PCR方法，排除了已知常见的引起肠道感染的病毒（肠道腺病毒、轮状病毒A组、轮状病毒B组、轮状病毒C组、诺如病毒Ⅰ型、诺如病毒Ⅱ型、札如病毒、人星状病毒）[10]，在尚无发现的情况下，随机选择小部分样本，采用了灵敏度更高，病原体靶标更多的FilmArray多重PCR法，发现了可能引起此次腹泻疫情的STEC。接下来对所有的病人样本进行检测，选择荧光定量PCR实验方法，在验证上述结果正确的同时，共发现5 例样本为EHEC（Stx1/eae阳性）。EHEC感染症状轻重不一，可为无症状感染、轻度腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome, HUS）等，然而，HUS多发生在带Stx2基因的EHEC感染中。本疫情中病例主要症状为恶心、呕吐、腹痛、腹泻，个别伴发热，未发现血便。我们在接下来的工作中将分离培养该致病菌，进一步研究该菌致病特征及进行同源性分析等。