MiR-206和CDK 4在神经脑胶质瘤中的表达及临床意义

王晓华 胡金钰

海阳市人民医院神经外科，山东 265100

神经脑胶质瘤是大脑和脊髓质细胞癌变导致原发性颅脑恶性肿瘤［1］，具有进展快、高复发率、高病死率、预后差等特点［2］。神经胶质瘤是最常见的恶性脑瘤之一，约占恶性脑瘤的55%左右［3］。神经脑胶质瘤的发生是一个多基因、多环节异常改变的综合进展过程，分子机制错综复杂，致使临床上治疗和预后改善效果甚微。目前临床主要采用胶质瘤全切术配合放化疗治疗神经脑胶质瘤，但总体治疗效果仍不甚理想［4］。因此，探究其发病机制，可为临床更好的治疗提供帮助。miRNA与癌症的发生和进展过程有关。有关研究显示，miR-206在胶质母细胞瘤组织中低表达，通过靶向调控BCL-2表达影响胶质母细胞瘤的发展［5］。细胞周期依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）参与细胞周期调控，与乳腺癌细胞增殖、侵袭性生长密切相关［6］。研究表明CDK4在胶质母细胞瘤中高表达，与肿瘤细胞增殖有关，抑制CDK4表达可靶向治疗胶质母细胞瘤［7］。但miR-206与CDK4在神经脑胶质瘤组织中的表达及与预后的关系尚不清楚。本研究旨在探究miR-206与CDK4在神经脑胶质瘤组织中的表达及与神经脑胶质瘤患者临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年8月至2015年10月在本院就诊的神经脑胶质瘤患者74例为研究对象，入院时统计患者临床病理资料。患者中男40例，女34例；年龄范围15～58岁，＜50岁者39例，≥50岁者35例；肿瘤大小≤3 cm者32例，＞3 cm者42例；WHO分级中Ⅰ～Ⅱ级36例，Ⅲ～Ⅳ级38例；核分裂≤2者29例，＞2者45例。（1）纳入标准：①所有患者均符合《中国脑胶质瘤分子诊疗指南》（2014）诊断标准［8］且经术后病理学确诊为神经脑胶质瘤患者；②患者均为原发胶质瘤且首次行胶质瘤全切术；③经沟通后获得患者及家属同意获取组织，并签署知情同意书。（2）排除标准：①患者胶质瘤全切术后复发，再次手术者；②合并其他恶性肿瘤、全身系统性疾病及免疫性疾病者；③依从性差无法配合完成治疗者；④非正常死亡患者。本研究经本院医学伦理委员会批准通过。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及与预处理 患者行胶质瘤全切术中取胶质瘤组织及瘤周组织（＞3 cm），以生理盐水洗净，一部分放于液氮中速冻5 min后置于-80℃冰箱用于提取总RNA，另一部分备用。

1.2.2 胶质瘤组织及瘤周组织中miR-206和CDK4 mRNA表达水平分析 取出冻存标本，冰上解冻，按照Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司生产）说明书提取组织总RNA，经琼脂糖电泳检测后确保RNA纯度且无降解，取2μg以miRNA反转录试剂盒（TaKaRa公司生产）反转录为cDNA。荧光定量PCR反应体系参照SYBR Green PCR master mix试剂（TaKaRa公司生产）说明加配反应体系，每个样品设置3次生物学重复。反应体系：2×Master mix 8μl、cDNA 1μl、20×SYBRI 1μl、PCR forward primer 0.5μl、PCR reverse primer 0.5μl、加无RNase H2O至总体积为20μl。体系加配完成后，放入Bio-Rad荧光定量PCR仪进行反应，反应程序设置：97℃预热3 min，95℃变性45 s，63℃退火30 s，共40个循环。反应结束后收集数据。miR-206以U6为内参基因，CDK4以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt算法计算miR-206和CDK4 mRNA相对表达水平。引物由北京六合华大基因公司合成，引物序列见表1。

1.2.3 组织CDK4蛋白表达检测 以10%中性缓冲甲醛固定胶质瘤组织及瘤周组织，完成固定后行石蜡包埋切片HE染色，中性树脂进行封片，置于显微镜下进行观察。观察时随机取10个高倍镜视野进行病理切片观察，并对阳性细胞数量进行统计。CDK4阳性大多数位于细胞核中，均以棕黄色颗粒特异性分布于细胞核者视为阳性细胞。由2名主治病理医生分别独立执行，采用双盲法阅片。按照阳性细胞百分比记分：＜5%0分，5%～20%1分，21%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分；按照染色程度：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，褐黄色3分。取两组积分乘积，≤2分为阴性，＞2分为阳性。

1.2.4 生物信息学软件预测miR-206和CDK4的关系 关于miR-206与CDK4之间的关系主要采用生物信息学网站（http：//www.microrna.org）进行预测分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 随访 以复诊或电话等方式对神经脑胶质瘤患者术后生存情况进行随访，记录患者从手术治疗到肿瘤进展引起死亡的患者例数计算无进展生存率（progressive-free survival，PFS）。随访时间为期36个月，自手术当天始，截止至2018年11月1日。所有患者均完成随访，无一例患者失访。

1.4 统计学方法 以统计学软件SPSS 17.0对本研究数据进行统计分析，计数资料以例（%）表示，比较行χ2检验；正态分布的计量资料以（±s）表示，比较行配对t检验；Kaplan-Meier分析神经脑胶质瘤患者术后3年生存情况。COX回归模型分析影响神经脑胶质瘤患者预后的危险因素；Pearson相关性分析法分析神经脑胶质瘤组织中miR-206和CDK4 mRNA表达水平的相关性，各组数据均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胶质瘤组织和瘤周组织miR-206和CDK4 mRNA表达分析 神经脑胶质瘤患者胶质瘤组织中miR-206表达水平显著低于瘤周组织（P＞0.05），CDK4 mRNA表达水平显著高于瘤周组织（P＞0.05），详见表2。

表2 74例神经脑胶质瘤患者胶质瘤组织和瘤周组织miR-206和CDK4 mRNA表达分析（±s）

表2 74例神经脑胶质瘤患者胶质瘤组织和瘤周组织miR-206和CDK4 mRNA表达分析（±s）

注：miR-206为微小RNA-206，CDK4为细胞周期依赖性激酶4，U6与β-actin均为内参基因

组织类型瘤周组织胶质瘤组织t值P值miR-206/U6 1.02±0.17 0.68±0.14 12.764＜0.001 CDK4/β-actin 1.01±0.18 1.48±0.27 12.205＜0.001

2.2 神经脑胶质瘤CDK4蛋白表达分析 免疫组化结果显示CDK4蛋白位于细胞核中，染色呈浅黄色、棕黄色，见图1。神经胶质瘤组织CDK4蛋白阳性表达率显著高于瘤周组织［66.22%（49/74）比22.97%（17/74）］（χ2＝28.003，P＜0.001）。

2.3 miR-206、CDK4表达水平与神经脑胶质瘤患者临床病理特征关系 根据胶质瘤组织中miR-206表达水平将患者分为miR-206高表达组和miR-206低表达组，根据免疫组化结果将患者分为CDK4阳性表达组和CDK4阴性表达组。结果显示miR-206、CDK4表达水平与神经脑胶质瘤患者肿瘤长径、病理分级、肿瘤组织坏死有关（均P＜0.05），与患者性别、年龄无关（均P＞0.05），见表3。

2.4 miR-206、CDK4表达水平与神经脑胶质瘤患者预后的关系 对74例神经脑胶质瘤患者进行为期36个月的随访，Kaplan-Meier法分析显示，miR-206高表达患者的PFS中位时间28.12个月、无进展生存率45.95%，显著高于miR-206低表达患者的PFS中位时间16.69个月、无进展生存率32.35%；CDK4阳性表达患者的PFS中位时间16.32个月、无进展生存率35.71%，显著低于CDK4阴性表达患者的PFS中位时间27.38个月、无进展生存率45.72%，详见图2。

2.5 影响神经脑胶质瘤患者预后的危险因素分析COX单因素分析显示miR-206表达水平、CDK4表达水平、肿瘤长径、WHO分级、肿瘤组织坏死是影响神经脑胶质瘤患者预后的危险因素，多因素分析结果显示miR-206表达水平、CDK4表达水平是影响神经脑胶质瘤患者预后的独立危险因素，详见表4。

2.6 神经脑胶质瘤组织中miR-206、CDK4表达的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示miR-206和CDK4表达水平呈负相关（r＝-0.642，P＜0.001），详见图3A。生物信息学分析显示CDK4与miR-206具有靶向关系，详见图3B。

表3 74例神经脑胶质瘤患者miR-206、CDK4表达水平与临床病理特征的关系[例（%）]

3 讨 论

图1 细胞周期依赖性激酶4（CDK4）在神经脑胶质瘤患者组织中的表达分析（HE染色 ×400）；1A：阴性表达，1B：阳性表达 图2 74例神经脑胶质瘤患者微小RNA-206（miR-206）（2A）和细胞周期依赖性激酶4（CDK4）（2B）表达水平与无进展生存率的关系 图3 74例神经脑胶质瘤患者组织中微小RNA-206（miR-206）、细胞周期依赖性激酶4（CDK4）表达结果；3A：相关性分析，3B：生物信息学分析

神经脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见、最具侵袭性、致命性颅内肿瘤［2］。生活方式改变和工作压力增加，使神经脑胶质瘤发病率逐年升高。但神经胶质瘤的发病机制尚未完全清楚。研究表明，长期吸烟、酗酒、熬夜、环境污染、病毒感染、遗传等多种因素与神经脑胶质瘤发生有关，目前尚未有研究表明某个因素与神经胶质瘤患者发病有直接因果关系［9］。随着现代医学科技的快速发展，如手术切除治疗、放射疗法、化学疗法及综合疗法等应用于神经脑胶质瘤治疗，但复杂的发病原因导致神经脑胶质瘤患者治疗后总体预后较差［10］。因此，深入研究神经脑胶质瘤发生发展的分子机制，对神经脑胶质瘤患者病程监测及预后判断有重要意义。

恶性肿瘤的发生发展与多种基因表达异常有关，miRNAs是一类特殊的非编码小分子RNA，通过与靶基因3’UTR区域发生特异性结合，调控靶基因的表达，参与恶性肿瘤的发生发展及迁移过程［11］。已有研究表明miRNAs在神经脑胶质瘤的发生发展过程中发挥着关键作用。miR-200c在胶质瘤组织中低表达，抑制胶质瘤组织的生长和癌细胞的转移［12］，提示miRNA主要通过影响肿瘤组织的生长，参与胶质瘤的发展进程。miR-206是一种保守非编码RNA小分子，与多种肿瘤发展进程密切相 关［13］。有 关 研 究 表 明，miR-206在神经脑胶质瘤中表达下调，其可通过直接靶向抑制卷曲蛋 白7（FZD7）mRNA WNT/β-catenin途径，从而在神经脑胶质瘤中发挥肿瘤抑制作用，miR-206有可能是治疗神经脑胶质瘤的潜在靶标［14］。此外，Hao等［5］研究发现miR-206在胶质母细胞瘤组织中表达下调，与肿瘤细胞增殖和侵袭有关。本研究结果显示miR-206在神经脑胶质瘤组织中的表达水平显著低于瘤周组织，与Zhou等［14］研究趋势一致，表明miR-206表达水平 可能与神经脑胶质瘤发生有关。进一步研究发现miR-206表达水平与神经脑胶质瘤患者肿瘤长径、病理分级、肿瘤组织坏死有关，提示miR-206可能参与调控癌细胞增殖，影响患者肿瘤大小和病理分级。Kaplan-Meier分析结果显示miR-206低表达患者术后3年的无进展生存率显著低于miR-206高表达患者，提示miR-206可能通过影响肿瘤大小、病理分级、核分裂程度，间接影响患者的预后。COX分析结果显示miR-206表达水平是影响神经脑胶质瘤患者预后的独立危险因素。以上研究结果提示miR-206低表达可能参与神经脑胶质瘤的发生过程，可能通过影响神经脑胶质瘤患者的发病进程，影响患者预后。

表4 COX回归模型分析影响74例神经脑胶质瘤患者预后的危险因素

CDK4是一种细胞周期重要调控分子，能与细胞周期素D结合，促进细胞周期的转换，它的活性与结合周期素依赖性激酶抑制素还是与周期素结合有关［15］。研究表明CDK4主要调控癌细胞G1期向S期转换过程［16］，提示CDK4表达可能与恶性肿瘤的进展有关。在胶质母细胞瘤中CDK4高表达，参与胶质母细胞瘤病程进展，抑制CDK4表达可改善患者病情发展［7］，提示CDK4可能调控病程发展，影响患者治疗效果。本研究结果显示CDK4在神经脑胶质瘤组织中mRNA表达水平显著高于瘤周组织，与Xu和Li［7］研究结果类似，表明CDK4可能参与神经脑胶质瘤发病过程。免疫组化结果显示神经脑胶质瘤组织中CDK4蛋白阳性表达率显著高于瘤周组织，表明CDK4在神经脑胶质瘤组织中的mRNA与蛋白表达水平存在一致性。进一步分析发现，CDK4蛋白表达与肿瘤大小、病理分级、核分裂有关，CDK4高表达患者术后无进展生存率显著低于低表达者，提示CDK4高表达可能促进肿瘤增殖，导致不良预后。COX分析显示CDK4表达水平是神经脑胶质瘤患者预后的独立影响因素，提示检测CDK4表达水平对神经脑胶质瘤患者预后判断有一定意义。过往研究发现，miRNAs主要通过调控靶基因表达参与癌症发展，Georgantas等［17］研究表明miR-206通过靶向调控CDK4表达诱导黑色素瘤G1期停滞。凌晨等［15］学者通过探讨miR-206/CDK4信号在卵巢癌生长和化疗增敏中的作用显示，通过采用miR-206 mimics转染卵巢癌细胞，CDK4表达呈现明显抑制的情况，而在使用miR-206特异抑制剂后能明显恢复CDK4在卵巢癌细胞中的表达，另外荧光素酶报告基因活性分析显示，miR-206能特异结合到CDK4 3’UTR，抑制荧光素酶活性，因此其认为miR-206通过直接靶基CDK4，从而抑制细胞周期其他因子的表达，降低卵巢癌细胞的生长。还有学者实验研究发现，转染miR-206前列腺癌细胞中CDK4和细胞周期素G相关蛋白激酶（GAK）的表达水平显著降低，因此其认为miR-206可干扰两者的表达［18］。而本研究结果显示miR-206与CDK4 mRNA水平呈负相关，且生物信息学分析显示miR-206可靶向结合CDK4，提示miR-206可能通过靶向结合CDK4，进而参与神经脑细胞瘤发病进程，影响患者预后。

综上所述，miR-206在神经脑胶质瘤组织中表达下调，CDK4表达上调，miR-206可能通过负向调控CDK4表达参与神经脑胶质瘤发病进程，影响患者预后。本研究样本量较少，可能存在一定实验误差；此外，miR-206对CDK4调控机制有待进一步研究。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。