老年非小细胞肺癌患者放疗前后Treg及Foxp3 mRNA的变化

侯盼飞 祝丽晶 濮娟 潘艳★

肺癌发病率居恶性肿瘤第1 位，70%以上患者确诊时已是中晚期，放疗在肺癌的治疗中占有非常重要的地位［1］。但是放疗在激活机体抗肿瘤免疫的同时，也能引起机体的免疫抑制，出现肿瘤对射线的抵抗［2］。因此，如果放疗过程中能够解除机体的免疫抑制，即放疗联合免疫治疗，可以更有效地增强机体的抗肿瘤效应，改善患者的预后。调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）在机体内发挥重要的免疫抑制作用，且与放疗密切相关［3］。本研究通过流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术（reverse-transcription PCR，RT-PCR）测定非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）放疗过程中Treg 以及其叉头状螺旋转录因子3（Forkhead helix family transcription factor 3，Foxp3）mRNA 在放疗过程中的变化，试图为患者放疗联合免疫治疗提供干预的靶点以提高放疗疗效。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2019年1月-2019年12月收治的40例NSCLC 作为肺癌组，其中男23 例，女17 例；年龄平均（68.55±7.82）岁。纳入标准：①年龄≥60 岁；②病理确诊为NSCLC［4］；③患者未接受其他治疗，且开始采集标本后1月内不行手术及化疗，只接受单纯放疗的患者。排除标准：①慢性阻塞性肺疾病、哮喘急性发作期；②合并自身免疫系统疾病；③合并感染；④近一月使用过糖皮质激素或免疫抑制剂。选取同期在本院查体的50 例健康体检者作为对照组，其中男27 例，女23 例；年龄平均（67.38±7.99）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。该项目经本院伦理委员会批准且所有参与者均签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂

Varian 23-Ex 直线加速器购自美国Varian 公司，Navios 流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司，ABI7500PCR 扩增仪购自美国ABI 公司，人Treg 检测试剂盒购自美国BD 公司，RT-PCR 试剂盒、RNA 提取试剂及各种生化试剂购自上海生工生物工程股份有限公司。Foxp3基因引物P1：5′-CTGGGCTCCTCGCCTGAC-3′，P2：5′-CTCTCT-GCCCTCAGCCTTGC-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 放疗方法

采用Varian 23-Ex 直线加速器，肺癌组患者均采用6 MV X 线IMRT 外照射，常规分割2.0 Gy/f，总剂量DT 60 Gy/30f。

1.4 血样采集

对照组清晨空腹采集静脉血5 mL，采用肝素抗凝。肺癌组分别于放疗前、放疗期间（每隔6 次放疗）采集标本，方法同对照组。

1.5 Treg 检测

取静脉血100 μL 加入已标记好的流式管，分别加入FITC Mouse Anti-Human CD4、PE Mouse Anti-Human CD25、Alexa FluorR647 Mouse anti-Hu-man CD127 各20 μL，室温避光孵育15 min；加入裂解液，震荡混匀室温避光15 min，1 200 r/min 离心5 min，弃上清后加入2 mL PBS，1 200 r/min 离心5 min；弃上清后加入500 μL PBS 震荡后，流式细胞仪检测Treg 占CD4+T 淋巴细胞百分比。

1.6 Foxp3 mRNA 检测

Trizol 法提取血浆总RNA，用随机引物逆转录成cDNA，以cDNA 作为模板，按照试剂说明书配制反应体系，采用ABI7500 PCR 仪检测Foxp3mRNA 的相对表达水平。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料以（）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与肺癌组放疗前外周血检测指标的比较

肺癌组放疗前外周血Treg 占CD4+T 淋巴细胞百分比以及Foxp3mRNA 相对表达量均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、图1。

表1 两组外周血Treg 百分比、Foxp3 mRNA 相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of Treg percentage and Foxp3 mRNA relative expression between 2 groups（±s）

表1 两组外周血Treg 百分比、Foxp3 mRNA 相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of Treg percentage and Foxp3 mRNA relative expression between 2 groups（±s）

组别对照组肺癌组t 值P 值Treg 5.36±2.85 7.71±2.83 7.385 0.013 Foxp3 mRNA 1.38±0.71 2.59±0.86 22.367＜0.001

图1 外周血Treg 检测流式细胞图Figure 1 Flow cytometry of Treg detection in peripheral blood

2.2 肺癌组放疗期间外周血的检测指标变化

肺癌组放疗期间各阶段外周血Treg 占CD4+T淋巴细胞百分比自放疗后开始上升，至第18 次升至最高，与放疗前比较差异有统计学意义（P<0.05），然后逐渐下降，至第30 次与放疗前比较差异无统计学意义（P>0.05）。肺癌组放疗期间各阶段外周血Foxp3mRNA 相对表达量自放疗后开始上升，至第12 次升至最高，与放疗前比较差异有统计学意义（P<0.05），然后逐渐下降，至第30 次与放疗前比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 肺癌放疗各阶段Treg、Foxp3 mRNA 的变化（±s）Table 2 Changes of Treg and Foxp3 mRNA in different stages of lung cancer radiotherapy（±s）

表2 肺癌放疗各阶段Treg、Foxp3 mRNA 的变化（±s）Table 2 Changes of Treg and Foxp3 mRNA in different stages of lung cancer radiotherapy（±s）

注：a与放疗前相比，P<0.05。

分组放疗前放疗第6 次放疗第12 次放疗第18 次放疗第24 次放疗第30 次F 值P 值Treg 7.71±2.83 8.23±2.65 8.28±2.15 9.31±2.28a 9.18±3.06a 8.09±3.19 8.581<0.001 Foxp3 mRNA 2.59±0.84 3.07±0.89 3.25±1.00a 3.19±0.96a 3.10±0.92a 2.45±0.71 21.786<0.001

3 讨论

我国肺癌的发病率和病死率均位居恶性肿瘤之首，并以NSCLC 最为多见［5］。由于肺癌早期诊断较为困难，确诊时只有15%的患者能够手术治疗［5］。对于无法手术的患者，放疗是主要的治疗措施。放疗可直接杀死肿瘤细胞，并通过刺激局部免疫反应形成长期抗肿瘤效果［6］。然而，放疗在激活抗肿瘤免疫的同时，也能引起机体的免疫抑制，造成肿瘤对射线的抵抗，这种现象与免疫抑制性Treg 的调控密切相关［2-3，7］。

本研究的结果表明，肺癌组放疗前外周血Treg占CD4+T 淋巴细胞百分比及Foxp3mRNA 的相对表达水平均明显升高，这种现象在其它的恶性肿瘤中也得到证实［8-9］，但Treg 占CD4+T 淋巴细胞百分比以及Foxp3 mRNA 相对表达水平增多的机制并未具体阐明。有研究表明肿瘤细胞高表达环氧合酶2（Cyclooxygenase-2，COX-2），COX-2 可产生过量的诺前列酮，从而诱导Treg 的产生，同时还可促进Foxp3 mRNA 表达的上调［10］。另外，肿瘤微环境中增多的白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）以及未成熟抗原递呈细胞表达，可诱导Treg 的增殖［11］。Treg 可以通过细胞-细胞间的接触抑制、细胞因子途径两种途径抑制效应细胞的免疫反应，抑制机体的抗肿瘤免疫应答。因此，肿瘤机体内Treg 增多导致免疫耐受增强，加速肿瘤的进展［12］。

本研究结果显示，肺癌放疗过程中Treg 占CD4+T 淋巴细胞百分比以及Foxp3 mRNA 的相对表达量自放疗后开始逐渐上升，这与Zhang 等［3，13］的研究结论是一致的。放疗过程中Treg 升高的具体分子机制可能与放疗能够诱导和活化免疫抑制因子TGF-β、增加蛋白激酶B 的表达，进而促进Treg 生成、抑制Treg 凋亡有关［14］。Treg 和Foxp3 mRNA 升高至一定程度后又逐渐下降，这与Napolitano 等［15］在大肠癌中的研究一致，这种变化机制可能与microR-545 的表达有关。放疗期间Treg 及Foxp3 mRNA 变化，提示放疗进一步影响了机体的免疫耐受。

本研究探讨了机体内Treg 及Foxp3 mRNA 伴随放疗发生变化的现象及可能的机制。本研究亦存在一定的局限性：由于受严格的纳入和排除标准限制，首诊且仅行放疗的患者较少，致入组的样本量少，未按照肿瘤分期进行分组统计；另外，免疫系统的个体差异因素可能导致一定的偏倚。针对于上述问题，本课题组下一步的研究计划将纳入更多的患者，并对他们进行更长放疗时间的追踪，更精准地提炼出放疗过程中Treg 以及Foxp3mRNA 的变化规律，并对内部分子机制进行更深入的的研究。

放疗协同免疫治疗，应用前景广阔，研究肺癌放疗过程中Treg 及其Foxp3mRNA 的普遍变化规律具有重要意义。如能在放疗过程中选择适宜的时机干扰Treg 或Foxp3mRNA 的表达，将充分发挥抗肿瘤免疫效应细胞的功能，杀灭肿瘤细胞，提高肺癌放疗的疗效，改善患者的预后。