胰蛋白酶水解制备绿豆分离蛋白多肽的工艺

张玉霞*，梁琼，黎渊珠，邹亚男，薛梅，梁丽琴

1. 海南工商职业学院海洋学院（海口 570203）；2. 海南省食品药品检验所海口分所（海口 570311）；3. 海南科技职业大学化学与材料工程学院（海口 571126）4. 山西师范大学生命科学学院（临汾 041004）

胰蛋白酶是人体及动物体内普遍存在的一种蛋白水解酶[1]，胰蛋白酶在pH 5.0时最稳定，可在低温下贮存数周而不丧失活性；低于此pH时酶易变性；当pH 高于5.0时，酶易自溶而失去活性[2-3]。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对有碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基所组成的肽键有着高度的特异性[4]。胰蛋白酶不仅能水解肽键，而且也能水解酰氨键和酯键[5]。对其催化水解活性的敏感度为酯键＞酰铵键＞肽键[6]。用其来水解提取绿豆中的蛋白质，所得到的蛋白质有利于人体的吸收消化[7]，并可以直接用于制作饮料、果冻、糕点等食品，且无其他副作用，可促进食品工业的发展。

试验以绿豆磨粉为原料，用胰蛋白酶进行酶解，在酶解pH、温度（T）和[酶]/[底物]（[E]/[S]）等单因素试验基础上，对水解条件进行正交试验，以确定胰蛋白酶提取绿豆蛋白的最佳条件。然后，对在最佳提取条件下得到的绿豆蛋白溶液进行凝胶过滤层析法纯化，最后用纯化的绿豆蛋白样品做SDS-PAGE电泳，测得其中所含的蛋白质的分子质量。此次试验结果可以为绿豆蛋白的加工和利用提供理论的依据，从而带来很好的经济效益。

1 材料与试验方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试剂与材料

绿豆磨粉（临绿一号绿豆，九阳料理机磨粉）；胰蛋白酶（USA进口、上海化学试剂站分装厂）；牛血清白蛋白（Mr 6700、上海宏观生化技术有限公司）；考马斯亮蓝G 250（上海绿岛科技发展有限公司生产）；丙烯酰胺（C3H5HO、中国医药公司北京采购供应站）；N, N’-甲叉双丙烯酰胺（C7H10N2O2、中国医药上海化学试剂公司）；Sephadex G-200（上海化学试剂厂）；低分子量标准蛋白（Sigma公司，电泳纯）；上述试剂均为分析纯品。

1.1.2 主要仪器与设备

TGL-16G-A型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；UV-7504C紫外分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；LG10-2.4A型高速离心机（北京医用离心机厂）；BSZ-160自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂）；HL-2恒流泵（上海嘉鹏科技有限公司）；DYY-2C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；DYCZ-24D垂直电泳槽（北京市六一仪器厂）；KQ50型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XWT-S系列小型台式记录仪（上海自动化仪表股份有限公司）；层析实验冷柜（北京博医康实验仪器有限公司）；1×50 Z形层析柱（上海亚荣生化仪器厂）；HD-2001-B-C核酸蛋白检测仪（上海嘉鹏科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 绿豆磨粉蛋白含量及绿豆蛋白溶液多肽含量的测定

采用凯氏定氮法[8]进行测定。

1.2.2 绿豆蛋白多肽制备率的计算[9]

1.2.3 单因素法测定最佳水解条件[10-11]

1.2.3.1 最佳水解温度的测定

取10支试管，在各管加入0.5 g绿豆粉和9 mL pH 8.5的缓冲液，每两管为一平行组，分别编号为30，37，40，45和50 ℃，在每个试管中加入1 mL 0.5%胰蛋白酶液，摇匀后分别置于各温度的水浴锅中反应9h，时间到后取出置于100 ℃的水浴锅中灭酶10 min，冷却后以8 000 r/min离心10 min，取上清液定容至10 mL。用移液枪取10 μL，加990 μL蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝溶液，2 min后在595 nm下测定吸光度。

1.2.3.2 最佳水解时间的测定[12]

取22支试管，在各管中加入0.5 g绿豆面和9 mL pH 8.5的缓冲液，每两管为一平行组，分别按2，4，6，8，10，11，12，13，14，15和16 h编号，在每个试管中加入1 mL 0.5%胰蛋白酶液，整个反应体系为10 mL，使酶/底物浓度比为1%，摇匀后置于37 ℃的水浴锅中反应。到时间后分别取两管置于100 ℃的水浴锅中灭酶10 min，冷却，以8 000 r/min离心10 min，取上清液定容至10 mL。用移液枪取10 μL，加990 μL蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝溶液，2 min后在595 nm下测定吸光度。

1.2.3.3 最佳水解pH的测定

取14支试管，在各管加入0.5 g绿豆粉，每两管为一平行组，分别加入pH 7，7.5，8，8.5，9，9.5和10的缓冲液各9 mL，加1 mL 0.5%的酶液，置于37 ℃的水浴锅中反应9 h，时间到后分别取出置于100 ℃的水浴锅中灭酶10 min，冷却，以8 000 r/min离心10 min，取上清液定容至10 mL。用移液枪取10 μL，加990 μL蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝溶液，2 min后在595 nm下测定吸光度。

1.2.3.4 最佳[酶]/[底物]的测定

取10支试管，在各管加入0.5 g绿豆粉和9 mL pH 8.5的缓冲液，每两管为一平行组，分别编号为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%，在0.5%组的试管中加入0.5 mL 0.5%胰蛋白酶液，1%的加入1 mL，1.5%的加入1.5 mL，2%的加入2 mL，2.5%的加入2.5mL，摇匀后分别置于37 ℃的水浴锅中反应9 h，时间到后取出置于100 ℃的水浴锅中灭酶10 min，冷却后以8 000 r/min离心10 min，取上清液定容至10 mL。用移液枪取10 μL，加990 μL蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝溶液，2 min后在595 nm下测定吸光度。

1.2.4 正交试验测定最佳水解条件[13-15]

在单因素试验基础上，分别为4个因素设置3个合适的水平，因素水平如表1所示。

表1 因素水平表

1.2.5 凝胶层析法纯化绿豆蛋白多肽[16-18]

将凝胶预处理后装柱（试验所选用的柱子型号为0.9 cm×30 cm），根据预计的床体积，称取所需的Sephadex G-100干凝胶放入锥形瓶中，加入适量的蒸馏水，然后置于沸水浴中煮沸2 h。加样时要求平整的柱床平面，用滴管将清蛋白（约5 mL）缓慢而均匀地加到柱床表面，待样品渗入后，用滴管沿柱壁向柱内加入少量的洗脱液，待洗脱液距柱床表面1～2 mm时，再用滴管加入约4 cm的洗脱液，接上恒压洗脱瓶开始洗脱，并马上打开调整好的收集器开始收集，流速为5 mL/（6 min·管），收集30管。用同样的方法将球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白层析纯化；样品全部收集后，在280 nm波长处测定其吸光度，并绘制洗脱曲线。

1.2.6 绿豆多肽的超滤膜分离[19-20]

配制5%浓度的绿豆多肽酶解液，首先用截留分子质量为5 kDa的超滤膜进行一级超滤处理，压力0.18 MPa。其次用截留分子质量为1 kDa的超滤膜对滤过液进行二次处理，压力为0.21 MPa。

1.2.7 绿豆蛋白多肽的氨基酸组成分析[21]

在最佳工艺条件下制备绿豆蛋白多肽，采用高效液相色谱仪测定其氨基酸组成。

2 试验结果与分析

2.1 温度、时间、pH、[酶]/[底物]对绿豆蛋白提取率的影响

2.1.1 温度对提取率的影响

从图1可以看出，在37 ℃时，胰蛋白酶对绿豆蛋白多肽的制备率较高，而低于或是高于37 ℃时，提取率都很低。任何酶反应都有其最适的温度范围，低温使酶的活性基团发生钝化，随着温度的升高，酶的活性基团逐渐被释放，而当温度超过最适温度时，随着温度的升高，酶的结构发生改变，活性下降，提取率亦随之下降。胰蛋白酶在37 ℃时活性最高，这与人和动物的体温环境较为吻合，能够较好地消化食物中的蛋白质。

图1 温度对绿豆蛋白多肽制备率的影响

2.1.2 时间对提取率的影响

从图2可以看出，在15 h之前随着水解时间的延长，绿豆蛋白多肽的制备率增长趋势显著，近似正比关系；在15 h之后，水解增长趋势减缓。这主要是因为随着水解时间的延长，水解产物的浓度逐渐增大，过高的产物浓度会对水解反应产生抑制作用。

图2 时间对绿豆蛋白多肽制备率的影响

2.1.3 pH对提取率的影响

从图3可以看出，在碱性条件下，绿豆蛋白的提取率随着pH的升高而增加，在pH 8.5之前呈正比增长，pH 8.5之后增长趋势较缓慢，增长量很小。因此，在pH 8.5的条件下提取较为合适。

图3 pH对绿豆蛋白多肽制备率的影响

2.1.4 [酶]/[底物]对提取率的影响

从图4可以看出，随着[酶]/[底物]的增加，绿豆蛋白的提取率也在增加，在1.5%之前，提取率的增长较快，而在1.5%之后，提取率的增长较缓慢。这主要因为在底物浓度不能被酶完全饱和时，提取率随[酶]/[底物]的增加而呈正比增加，但当酶浓度逐渐增加到底物浓度不能使其饱和时，提取率不再随其呈正比增加。

图4 [酶]/[底物]对绿豆蛋白多肽制备率的影响

2.2 正交试验确定酶解条件的最佳组合

从表2可以看出，4个因素对胰蛋白酶水解制备绿豆蛋白多肽的影响程度大小依次为A＞B＞D＞C，其最佳组合为A3B3C3D3，即温度37 ℃，时间15 h，pH 9，酶/底物2%。此外时间越长，水解越彻底，提取率越高，但考虑到这样耗时，于生产益处不大，酶量大有利于提取率的提高，但是这样也会增加成本，且增加能耗，从表2可以看出，当酶/底物比为2%时，制备率与1.5%时相比并没有较大的提高。故适宜的酶解条件为温度37 ℃，时间15 h，pH 9，酶/底物1.5%。

表2 正交试验结果

2.3 凝胶层析

从图5可以看出，从1～38管之间均有吸光度，即均含有蛋白质，高峰管为16～21管之间，从1～38管中选取几管用作SDS-PAGE电泳。

图5 绿豆蛋白的层析图谱

2.4 超滤膜分离绿豆蛋白多肽

绿豆蛋白水解液经超滤膜超滤分离，共得到3个分子质量组分的多肽，分别为＜1 kDa，1～5 kDa以及＞5 kDa。对3个组分进行比例分析，其所占比例分别为35.63%，56.24%及8.13%，这说明胰蛋白酶酶解后的绿豆蛋白多肽的分子质量大多＜5 kDa，有利于人体吸收。

2.5 绿豆蛋白中氨基酸组成

绿豆蛋白在酸水解过程中，色氨酸被破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺被水解成天冬氨酸和谷氨酸，因而表3中天冬氨酸和谷氨酸的含量都很高。与8种必需氨基酸的FAO/WHO推荐值相比，绿豆蛋白中的Val（缬氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Leu（亮氨酸）、Phe（苯丙氨酸）及Lys（赖氨酸）含量分别都比较高，除了Cys（半胱氨酸）含量较低外，其余必需氨基酸含量均接近或达到FAO/WHO推荐值，整体氨基酸含量较均衡，因而具有蛋白质开发应用价值。

表3 绿豆蛋白的氨基酸组成及含量 单位：g/100 g蛋白

3 结论

1) 绿豆磨粉在胰蛋白酶作用下水解生成绿豆水解蛋白液，其最佳水解条件为酶解温度37 ℃，pH 9.0，时间15 h。[酶]/[底物]1.5%。在此条件下，胰蛋白酶1次制备绿豆蛋白多肽的提取率可达60.50%。

2) 利用超滤膜对绿豆多肽酶解液超滤分离，共得到3个分子质量组分的多肽，分别为＜1 kDa，1～5 kDa以及＞5 kDa。对3个组分进行比例分析，其所占比例分别为35.63%，56.24%及8.13%，这说明胰蛋白酶酶解后的绿豆蛋白多肽的分子质量大多＜5 kDa，有利于人体吸收。

3) 高效液相色谱分析绿豆蛋白多肽的氨基酸组成，将结果与8种必需氨基酸的FAO/WHO推荐值相比，绿豆蛋白多肽中的Val（缬氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Leu（亮氨酸）、Phe（苯丙氨酸）及Lys（赖氨酸）含量分别都比较高，除了Cys（半胱氨酸）含量较低外，其余必需氨基酸含量均接近或达到FAO/WHO推荐值，整体氨基酸含量较均衡。