大孔树脂纯化纵条纹炭角菌中环肽Xylastriamide A工艺

任志洋，唐凡淋，袁小红*

西南科技大学生命科学与工程学院（绵阳 621000）

纵条纹炭角菌（Xylaria striataPat. 1887）为子囊菌门（Ascomycota）炭角菌科（Xylariaceae）炭角菌属（XylariaHill ex Schrank）真菌，生长范围主要在腐朽树皮和活树根上[1]。前期对纵条纹炭角菌进行多年研究，包括纵条纹炭角菌子实体的培养[1]、液体培养优化[2-3]、子实体化学成分研究[4]及抗菌活性方案[5]、抗肿瘤活性[6]等，为纵条纹炭角菌的开发利用提供基础。从炭角菌属真菌的菌丝体中分离得到多种新颖的化合物，且证明其具有良好的生物活性[7]。环肽物质因其特殊的结构和构象关系[8]而具有较好的抗肿瘤、抗癌活性[9]，其在新药开发中得到了极大的重视。雷传文[10]运用多种色谱技术从纵条纹炭角菌中分离得到一种新的环肽Xylastriamide A，其作为一种新颖的环肽类物质，发现具有显著的抗肿瘤活性，并且对秀丽隐杆线虫也有一定的抗虫活性，表明该环肽有着极大的研究价值和应用前景。

该类化合物传统的分离方法[11]是通过一系列的色谱技术进行纯化，从而获得单体物质，该法步骤多且效率低，会耗费大量的溶剂和时间，且固相吸附严重。为更好地对环肽Xylastriamide A进行研究开发，有必要改良该环肽的分离纯化过程，从而为该环肽的进一步分析提供基础保障。大孔吸附树脂因其吸附效果好，操作简便，可反复使用的特性，被广泛运用于中药材的有效成分富集及分离纯化工艺中[12-13]。为很好地对环肽Xylastriamide A进行分离，试验以纵条纹炭角菌为材料，采用不同型号、性能的树脂对纵条纹炭角菌环肽进行吸附、解吸试验，筛选出最适宜分离该环肽的树脂，并对纵条纹炭角菌环肽分离纯化条件进行优化，以达到对环肽富集的效果，为纵条纹炭角菌的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

纵条纹炭角菌（2012年7月由贺新生教授采于西南科技大学杨树桩，鉴定为炭角菌科炭角菌属纵条纹炭角菌Xylaria striataPat. 1887）。

盐酸（分析纯）；氢氧化钠（分析纯）；无水乙醇（分析纯）；乙腈（色谱纯）；超纯水。

根据环肽Xylastriamide A的极性，故选择不同型号的大孔树脂来进行后续研究。

表1 不同型号的大孔吸附树脂参数

1.1.2 仪器与设备

XJ-2小型提取浓缩机组（天津大明制药设备厂）；高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1260Infinity）；色谱柱（Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）；SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵；Rotavapor R-210旋转蒸发仪。

1.2 方法

1.2.1 纵条纹炭角菌粗提液制备

取纵条纹炭角菌子实体，粉碎过孔径0.425 mm筛，按料液比1︰5（g/mL）加入90%乙醇在70 ℃下浸提3次，每次2 h，合并滤液，旋转蒸发浓缩至浸膏后，加入蒸馏水溶解，得到纵条纹炭角菌粗提液。

1.2.2 纵条纹炭角菌中环肽Xylastriamide A含量测定

采用HPLC法，准确称取1 mg纵条纹炭角菌环肽Xylastriamide A标准品，用乙腈将其溶解，配成一系列的质量浓度梯度溶液。按照流动相采用乙腈-水（65︰35），流速1.0 mL/min，检测波长216 nm，进样量20 μL，柱温35 ℃，等度洗脱的方式，在该条件下测定目标物峰面积，以峰面积（Y）和环肽质量浓度（X）作图，得标准回归曲线方程为Y=32.789X+2.198 6（R2=0.999 6），线性关系良好。

1.2.3 大孔树脂预处理[14]

将新购买的大孔树脂（H103、HP20、D101、AB-8）用无水乙醇浸泡过夜，使其充分溶胀，再湿法装柱，用乙醇洗至流出液不浑浊为止，用蒸馏水冲洗至无醇味。依次酸洗，用2 BV的5%盐酸溶液浸泡4 h，用蒸馏水洗至中性；碱洗，用2 BV的2%氢氧化钠溶液浸泡4 h，用蒸馏水洗至中性。备用。

1.2.4 大孔树脂筛选

分别取预处理好的不同类型的大孔树脂（AB-8、D101、HP20、H103）适量，用滤纸吸干水分后，各自称取1 g于100 mL锥形瓶中，加入20 mL的纵条纹炭角菌粗提物，置于摇床中（25 ℃，120 r/min）静态吸附24 h。各自取一定量上清液测定环肽Xylastriamide A浓度，按式（1）计算出各树脂对该环肽的吸附率。将大孔树脂取出，用滤纸吸干表面提取液，加入100%乙醇20 mL进行静态解析，解吸液经HPLC测定环肽含量并按式（2）计算各树脂对该环肽的解析率。

式中：E1为树脂的吸附率，%；C0为吸附液中环肽的初始质量浓度，mg/mL；C1为吸附后剩余的环肽质量浓度，mg/mL。

式中：E2为树脂解吸率，%，C0为吸附液中环肽初始质量浓度，mg/mL；C1为吸附后剩余环肽质量浓度，mg/mL；C2为解吸液中环肽质量浓度，mg/mL；V1为吸附液体积，mL；V2为解吸液体积，mL。

1.2.5 大孔树脂静态吸附研究

取处理好的D101树脂，用滤纸吸干水分，称取1 g于100 mL锥形瓶中，加入20 mL的纵条纹炭角菌提取液，置于摇床中（25 ℃，120 r/min）静态吸附24 h，并分别在1，2，3，4，6，8和12 h取样进行HPLC检测，测定环肽Xylastriamide A含量，按式（3）测量吸附量，作吸附量-时间图。

式中：Qc为树脂的吸附量，mg/g；C0为吸附液中环肽的初始质量浓度，mg/mL；C1为吸附后剩余的环肽质量浓度，mg/mL；V1为吸附液体积，mL；M为树脂质量，g。

1.2.6 大孔树脂对该环肽的动态吸附条件优化[15]

1.2.6.1 不同上样流速对大孔树脂吸附效果的影响

取100 mL质量浓度3 mg/mL的纵条纹炭角菌提取液，改变上样流速进行动态吸附，柱体积（BV）为30mL，分别以1，2，3，4和5 BV/h的流速上柱吸附，收集流出液，计算吸附率。作吸附率-流速图。

1.2.6.2 不同上样浓度对大孔树脂吸附效果的影响

取4份3 mL质量浓度100 mg/mL的纵条纹炭角菌提取液，分别加入297，97，57和39.8 mL用水制成1，3，5和7 mg/mL的混悬液，柱体积（BV）30 mL，流速2 BV/h，以不同质量浓度上柱吸附，收集流出液，计算吸附率。作吸附率-质量浓度图。

1.2.6.3 不同上样量对大孔树脂吸附效果的影响

取质量浓度3 mg/mL的纵条纹炭角菌提取液，以2 BV/h的吸附流速上柱，每处理1 BV样液（1 BV=30 mL）的流出液单独收集，测定流出液中的环肽Xylastriamide A浓度。流出液中该环肽质量浓度达到上样液质量浓度的10%时，确定树脂的吸附已达到饱和[16]。作流出液质量浓度-流出液体积图。

1.2.7 大孔树脂对该环肽的动态解吸条件优化

1.2.7.1 不同体积分数乙醇对大孔树脂解吸条件的影响

取质量浓度3 mg/mL的纵条纹炭角菌提取液7 BV（5份），分别以2 BV/h上柱吸附，收集流出液，计算吸附量，用3 BV的40%乙醇解吸，测定流出液中环肽Xylastriamide A含量，分别用60%，70%，80%，90%和100%乙醇溶液进行解吸，解吸流速为2 BV/h，收集解吸液，测定环肽Xylastriamide A浓度，计算解析率，比较不同体积分数解吸剂对大孔树脂解吸效果的影响。

1.2.7.2 洗脱剂量对大孔树脂解吸条件的影响

取质量浓度3 mg/mL的纵条纹炭角菌提取液7 BV，以2 BV/h上柱吸附，收集流出液，计算吸附量，用3 BV的40%乙醇洗去杂质，用100%乙醇溶液进行洗脱，每1 BV单独收集，测定环肽Xylastriamide A浓度。作流出液质量浓度-洗脱液量体积图。

1.2.8 纯化工艺验证

取质量浓度3 mg/mL的纵条纹炭角菌提取液7 BV，以2 BV/h上柱吸附，收集流出液，计算吸附量，用3BV的40%乙醇洗去杂质，用3 BV的100%乙醇溶液进行解吸。平行操作3次，按最佳工艺条件，通过HPLC分析大孔树脂处理前后环肽Xylastriamide A占比。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的筛选

由表2可以看出，4种大孔吸附树脂对纵条纹炭角菌中环肽的吸附和解吸效果不同。在这4种大孔树脂中，HP20、D101、AB-8均对纵条纹炭角菌中环肽有着较好的吸附率和解析率，但D101的吸附率最大，解析率适中，且D101更加适合工业生产使用，因此，综合考虑，选用D101作为纯化纵条纹炭角菌中环肽的最佳树脂。

表2 不同型号的大孔吸附树脂筛选

2.2 大孔树脂静态吸附动力学曲线

由图1可以看出，D101大孔树脂在0～4 h之间，吸附量随着时间延长呈现急剧增加趋势，为快速吸附阶段；在4～6 h之间，吸附量增加不明显，为慢速吸附阶段；6 h以后，吸附量的变化不大，树脂的吸附已经接近饱和。故在实际应用中，综合考虑生产周期、效率等因素，上柱液静态吸附最佳时间为6 h。

2.3 大孔树脂对该环肽的动态吸附条件优化

2.3.1 不同上样流速对大孔树脂吸附效果的影响

由图2可知，随着上样流速增加，环肽的吸附率不断降低。可能是上样流速较慢时，该环肽在柱中下降的速度较慢，有利于该环肽在树脂内的扩散，让树脂与该环肽得以更加充分的接触和吸附，上样流速变快时，上样液中的环肽成分未能充分的扩散到树脂内就被冲出柱外，使树脂对环肽的吸附率降低。对照图2，1和2 BV/h时均有较大的吸附率，综合时间考虑，选择2 BV/h为最佳上样流速。

图1 大孔吸附树脂静态吸附动力学曲线

图2 上样流速对D101大孔树脂吸附效果的影响

2.3.2 不同上样质量浓度对大孔树脂吸附效果的影响

由图3可知，D101树脂吸附率随着上样液质量浓度增加而降低，1 mg/mL时对应的吸附率最大，这也符合低质量浓度有利于吸附的原则。随着上样质量浓度增加，吸附率下降程度逐渐增大，可能是上样质量浓度大时，环肽对于大孔树脂的吸附存在竞争，同时上样质量浓度过大会导致大孔树脂柱堵塞，影响使用。1和3 mg/mL的吸附率相差不大，综合时间、效率考虑，选择3 mg/mL为最佳上样质量浓度。

图3 上样质量浓度对大孔树脂吸附效果的影响

2.3.3 不同上样量对大孔树脂吸附效果的影响

由图4结果可以看出，随着上样量增加，流出液中环肽质量浓度不断增加，根据泄漏点的定义，上样量7 BV时，此时的流出液中环肽质量浓度达到上样液中环肽质量浓度的10%，继续增加上样量，会使流出液环肽质量浓度继续增加。因此，优选最佳上样量为7 BV。

图4 上样量对大孔树脂吸附效果的影响

2.4 大孔树脂对该环肽的动态解吸条件优化

2.4.1 不同体积分数乙醇对大孔树脂解吸条件的影响

由图5可知，体积分数40%的乙醇进行洗脱时，流出液中检测不到环肽，说明40%乙醇不能使目标物洗脱，即可以用来除去杂质；乙醇体积分数60%时，环肽开始有少量泄露；随着乙醇体积分数增大，解吸率也随之提高，乙醇体积分数100%时，解吸率最高。因此，优选100%乙醇作为洗脱液。

图5 乙醇体积分数对大孔树脂解吸条件的影响

2.4.2 洗脱剂量对大孔树脂解吸条件的影响

由图6可知，洗脱液中环肽含量随洗脱液增加而呈现先上升后下降趋势，洗脱量达到3 BV时，流出液中环肽含量较低，此时环肽基本被洗脱，因此最佳洗脱剂量为3 BV。

2.5 纯化工艺验证

结果见表3，可以得出，纵条纹炭角菌粗提物中Xylastriamide A纯度为4.13%，经过大孔树脂纯化后，该环肽含量平均纯度为39.63%，纯化后该环肽纯度有极大提高，说明D101对纵条纹炭角菌中的环肽Xylastriamide A纯化效果良好。

图6 洗脱剂量对大孔树脂解吸条件的影响

表3 Xylastriamide A在大孔树脂中纯化前后对比

3 结论与讨论

通过比较4种大孔吸附树脂（H101、HP20、D101、AB-8）对纵条纹炭角菌中环肽Xylastriamide A的吸附-解析效果影响，同时对D101大孔树脂的静态吸附及静态动力学进行研究，结果表明，D101大孔树脂对纵条纹炭角菌中环肽Xylastriamide A具有较好的吸附-解吸作用，且综合成本考虑，选用D101大孔吸附树脂来分离纯化纵条纹炭角菌中环肽。

D101大孔树脂对纵条纹炭角菌中环肽动态吸附-解吸的最佳工艺条件为上样液质量浓度3 mg/mL，上样流速2 BV/h，上样量7 BV；解吸时用40%乙醇3 BV洗去杂质，用100%乙醇3 BV解吸，解吸流速2 BV/h。

D101大孔树脂经过多次的吸附-解吸试验，其依然具有良好的吸附效果，说明D101大孔树脂具有较好的重复利用性，且树脂预处理简单，成本低廉，安全无害，适合工业生产或者大规模利用。采取该工艺分离纵条纹炭角菌中环肽Xylastriamide A可以减少环肽损失，提高环肽纯度，也为用D101树脂来分离纯化其他类型的环肽研究奠定基础，提供一定参考价值。