骨康灵液在骨折愈合中影像学及组学的研究

王琼仙，杨骐睿，李成，王金伟，吴春妍，吴林雄

（1 昆明医科大学实验动物学部,云南 昆明；2 云南省骨科医院,云南 昆明；3 昆明医科大学公卫学院,云南 昆明；4昆明医科大学药学院,云南 昆明)

0 引言

骨康灵液是一种院内制剂，是由昆明医学院科研中试中心研发，经由云南省药监局批准生产。由10 多味中药经炮炙、加工、提取其有效成份后，对其进行一系列的制备，而最终形成的一种药液，是一种外用药物[1，2]。骨康灵液经过试验发现，在接骨生新方面具有较好的效果，而且对于骨折患者恢复中的骨痂生长具有有效的促进作用，从而更好地帮助骨折患者康复，另外在外伤性闭合骨折及跌打损伤、关节红肿疼痛等疾病中，还可有效发挥其活血化瘀、消肿止痛的效用。

1 骨康灵液发挥疗效作用的动物实验研究

1.1 材料与方法

仪器：普通医用诊断X 摄线机（本部门实验室）及手术器械等。

药品：本院原制剂室提供，骨康灵液的批准文号为滇药制字(z)20092434A。

1.2 动物模型的建立与评价

（1）分组：200只成年SD 大鼠，雌雄各半，体重（200±20）g，随机分为四组。sham 组( 空白对照组),骨折组66只, 对照组( 骨折+95% 酒精组)66只和治疗组(骨折+骨康灵液)68只，其中空白对照组均为各组的SD 大鼠股骨左侧，其他3 组均为各组SD 大鼠股骨的右侧，每组多用几只动物备用。实验动物购于昆明医科大学实验动物学部，实验动物质量合格证号：SYSK(滇)2005-0004，许可证号SCXK(滇)2011-0004。

（2）制备骨折模型：随机选择右侧股骨制造股骨中段骨折，利用X 线技术观察患肢的具体情况，最后进行伤口的缝合处理(术后连续3d 每天按15万/kg 剂量的青霉素进行肌肉注射，有效预防感染)。

（3）给药：造模成功后，将药棉或纱布上浸满骨康灵液后，将其对治疗组的患处进行充分的包缠，并利用小夹板对其进行有效的固定处理，需要注意的是，要保证患处的药棉经常处于比较湿润的状态，每日可间隔6h 定时浸湿药棉1次，4次/d，从而有效帮助患处的药物吸收。分别于骨折造模成功给药后第7、15、21、30、42、50d 各组每次分别大鼠行腹腔麻醉后10只做X-线摄片观察骨折愈合情况及骨痂生长情况。对照组、治疗组骨折给药后1个月分别各取4只骨折断端的骨组织放入-80℃冰箱保存，干冰运输送检。基因芯片和蛋白质谱检测筛选骨康灵液发生疗效的上下调基因及目标分子。对照组用西医常规治疗（95%酒精）。

1.3 X-线影像评分标准

1分：骨折断端边缘呈现出一种趋向性模糊，骨膜轻度反应，无骨痂可见；2分：断端边缘模糊，骨膜反应浅淡，骨痂少量，密度较淡，边缘不整齐；3分：通过观察可以发现仍然可以看到接近消失的断端边缘，骨膜反应较深，骨痂增加，但缺损未完全填充，密度较深，边缘呈现出清晰的状态；4分：断端边缘完全消失，骨膜反应密度与骨影相似，骨痂未填满缺损，与骨皮质密度相同并未相互连接；5分：骨折恢复良好，断端边缘完全消失[3-5]。

1.4 统计学分析

以SPSS19.0 统计软件处理数据。X 线影像评分等为计量资料，对其使用（±s）表示，组间的数据对比采用单因素方差分析和t检验，P＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组造模后7-50d X 线分析

第7d 时，治疗组与对照组影像学无明显差异，治疗组骨折端符合X-线影像评分中1分的标准；第15d 时，治疗组有少量骨痂生长，边缘明显模糊，而对照组无骨痂生长；第21d 时，治疗组骨折断端骨密度有所增加，骨膜反应渐深，生成较多骨痂，断端边缘仍可见，对照组仅有少量骨痂生长；第30d 时，治疗组骨密度进一步增加，骨膜反应较深，骨痂量已包绕骨折断端，但骨折线清晰，对照组出现较多骨痂；第42d 时，治疗组骨折线基本消失，骨膜密度接近骨质，骨痂填满骨缺损，骨小梁力学结构渐为合理，对照组骨折线仍清晰，骨痂量较多，骨小梁杂乱；第50d 时X 线摄片，治疗组大部分符合5分的标准。结果:治疗组与对照组在造模第7d 的X 影像学无明显差异(P＞0.05)，在造模50d 时治疗组骨痂明显多于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组造模后7-50d X 线影像评分[（±s）/分]

表1 各组造模后7-50d X 线影像评分[（±s）/分]

组别 n 7d 14d 21d 30d 42d 50d治疗组 68 1.67±0.52 2.28±0.39 3.44±0.46 4.00±0.50 4.20±0.30 4.50±0.50对照组 66 1.00±0.55 2.00±0.27 3.00±0.33 3.50±0.11 3.60±0.34 3.70±0.30骨折组 66 0.2±0.11 0.3±0.22 0.4±0.33 0.5±0.39 0.7±0.40 0.9±0.50 sham 组 66 0.1 0.3 0.4 0.5 0.7 0.9

2.2 基因表达谱芯片实验

动物SD 大鼠治疗组4只（骨折+骨康灵液，2 雌，2 雄，样品编号A、B、C、D）；对照组4只（骨折，2 雌，2 雄，样品编号E、F、G、H）。表2 中可见，筛选出上调基因650个，下调基因157个，差异基因总数807个。A vs E 比较，筛选出上调基因2149个，下调基因1418个，差异基因总数3567个，其他的依此类推。

表2 两组差异基因统计比较

3 讨论

骨折愈合是一个相对较为复杂的过程，是骨折断端间的一种组织修复反应，在这个过程中，有较多的细胞及细胞因子参与其中，并起到协调的作用。而且该过程的实质是骨细胞的再生以及骨折的完全修复，局部骨生长因子在其中起着重要的调控作用，其对于愈合速度和质量意义重大[6-10]，但最终的目标是恢复骨骼的正常结构和功能。如何促进骨折愈合一直是医学领域的重要课题，中医药促进骨折愈合也是中医骨伤学的一个重要研究方向。

在本研究中，治疗组与对照组相比，在造模第7d X 影像学无明显差异(P＞0.05)，在造模50 天治疗组骨痂明显多于对照组(P＜0.05)。骨康灵液制剂可促使骨痂生长，骨康灵液对骨折愈合有修复作用[11,12]；基因芯片检测筛选上下调基因结果已经筛选出来了，而目标基因和分子的筛选检测实验还在准备中。有待于下一步进一步研究骨康灵液制剂发生疗效作用的愈合机制。