调脾护心方对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用*

张敏敏，袁良，王银燕，刘玲，刘攀，戴小华

1 安徽中医药大学 安徽合肥 230038

2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

3 安徽省中西医结合医院 安徽合肥 230031

心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指急性心肌缺血复灌后，非但不能减轻心肌组织损伤，反而加重甚至导致不可逆性损伤的现象。近年来，心肌缺血性疾病发生率总体呈不断上升趋势，介入治疗如经皮冠状动脉介入术（PCI）等技术在临床广泛开展，虽然可迅速恢复心肌血供，挽救更多濒死心肌，更大可能保护心脏功能，但亦可同时引发MIRI。越来越多的临床研究表明，在规范治疗的基础上，采用有效治疗手段减轻MIRI，能进一步保护心功能，改善心梗患者远期预后，已成为国内外学者研究热点[1-2]。

细胞凋亡、氧化应激、钙超载以及能量代谢障碍等多种机制参与MIRI的发生发展[3]，因此寻找多途径、多环节、多靶点治疗药物具有重要意义。调脾护心方由安徽省中医院心内科戴小华主任提出，由经方归脾汤和酸枣仁汤加减化裁，前期临床研究表明在治疗稳定型心绞痛、缺血性心肌病、缺血再灌注损伤等方面调脾护心方发挥显著疗效[4-5]；动物研究也发现[6-8]，调脾护心方可改善心肌梗死后心肌缺血，保护受损心肌。目前调脾护心方对MIRI的动物实验研究未见报道。本研究通过建立MIRI大鼠模型，探讨调脾护心方对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物 12周龄SD雄性正常大鼠，体重200g左右（200±20g），所有大鼠均由安医大动物实验中心[许可证SCXK（皖）2019-001]提供。确保大鼠分开饲养、食水充足、昼夜节律正常。操作过程中严格按照科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》以及《赫尔辛基宣言》基本原则处理动物。

1.2 实验药物 由安徽省中医院制剂中心提供中药“调脾护心方”（陈皮6g、白术10g、茯苓10g、酸枣仁10g、灸远志 6g、灸甘草 3g、广木香 6g、蒲公英 10g）；乌拉坦：临时使用生理盐水配制成浓度为20%的乌拉坦溶液。

1.3 试剂与仪器 天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒均购于Nanjing Jiancheng Biotechnology Co.LTD；心肌肌钙蛋白I（cTnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）试剂盒购于Beijing Andy Huatai Biotechnology Co.LTD；BX51光学显微均购自Olympus Optical。

2 方法

2.1 模型制备 参照文献[9]方法进行冠脉结扎。使用20%乌拉坦（1g/kg）溶液麻醉大鼠后，取仰卧位固定四肢；连接四通道生理记录仪（BL－420S生物机能实验系统），记录标Ⅱ导联心电图，发现异常者予以剔除；切开大鼠气管并插入气管套管作正压呼吸。备皮、消毒、开胸，挤出心脏，在室间沟处左心耳下方穿线，结扎LAD后将心脏回纳入胸腔，缺血30min后再灌注，结扎后立即关闭胸腔快速挤出胸腔内的气体，通过恢复负压，以助大鼠恢复自主呼吸。缝合，记录心电图，术后腹腔注射少量青霉素防止感染。结扎成功标志：结扎线远端心肌颜色紫绀，心电图显示为ST段抬高。模型制备成功标志：松开结扎线恢复冠脉血流，缺血心肌颜色恢复，抬高的ST段回落，表明模型制备成功。

2.2 分组及给药 40只大鼠随机分为4组：即模型组、假手术组、调脾护心方高、低剂量组。假手术组LAD只穿线不结扎，其他各组分别以术后成模大鼠进行后续试验，各组物如下：模型组（等量0.9%生理盐水，10mL/kg）、假手术组（等量0.9%生理盐水，10mL/kg）、调脾护心方低剂量组（调脾护心方5.85g生药/kg）、调脾护心方高剂量组（调脾护心方23.4g生药/kg），连续14天，一日2次，于第2周末禁食水，处理大鼠，分别收取标本检测。

调脾护心方高剂量组大鼠未发生死亡，假手术组、模型组、调脾护心方低剂量组因建模手术分别死亡1、2、1只（气管拔管失败死亡1只，结扎后即刻出现室颤死亡2只，术后感染死亡1只），实验结束存活大鼠为36只。

3 检测指标

3.1 心肌病理学改变 4%多聚甲醛固定大鼠心肌组织4h（4℃）后，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察其病理学改变。

3.2 血清 CK-MB、cTnI、AST、LDH、SOD、MDA 检测 第2周末，抽取大鼠腹主动脉血，3000r/min离心15min，取上清于-80℃冰箱保存备用，各项指标的测定严格按试剂盒说明进行。

4 统计学处理

所有数据均采用SPSS 26.0软件包_进行统计学处理。连续型变量以“均数±标准差（）”表示，多组之间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 MIRI大鼠造模成功心电图变化

见图1、图2、图3。图1、图2、图3分别展示了大鼠正常心电图、结扎LAD后心电图、解扎LAD恢复冠脉血流后心电图。图2见弓背向上抬高的ST段，图3可见抬高的ST段回落，表明MIRI模型制备成功。

图1 造模前心电图

图2 结扎LAD后心电图

图3 解扎LAD恢复冠脉血流后心电图

2 各组大鼠心肌HE染色结果比较

见图4。HE染色结果可见，假手术组心肌纤维排列整齐，细胞核清晰可见，心肌组织无明显的病理改变。模型组心肌纤维排列紊乱、扭曲，细胞核肿胀、聚集、破裂 ，心肌组织周围可见大量炎性细胞浸润。与模型组比较，调脾护心方组心肌纤维排列基本整齐，细胞核呈淡染，结构模糊，心肌组织伴少量炎性细胞浸润，高剂量组较低剂量组明显。表明调脾护心组可改善心肌缺血后损伤，维持细胞正常形态。

3 各组大鼠的血清心肌酶结果比较

结果表明，与假手术组比较，各组血清LDH、cTnI、AST、CK-MB均明显升高，各组数值具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；与模型组比较，调脾护心方高低剂量组均可降低血清LDH、cTnI、AST、CK-MB水平，差异有统计学意义（P＜0.05）；调脾护心方高低剂量组组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），表明调脾护心方能降低大鼠血清心肌酶水平，且存在药物剂量关系。见表2。

表2 各组大鼠的血清CK-MB、cTnI、AST、LDH水平比较（）

表2 各组大鼠的血清CK-MB、cTnI、AST、LDH水平比较（）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与调脾护心方低剂量组比较，▲P＜0.05。

组别 例数 CK-MB/ng·mL-1 cTnI/ng·L-1 AST/U·L-1 LDH/U·L-1假手术组 9 5.83±0.50 87.86±8.51 11.36±1.22 4362.94±115.78模型组 8 27.24±2.24** 291.34±39.15** 13.55±1.15** 6254.71±114.21**低剂量组 9 12.94±1.23**△ 200.02±24.64**△ 15.63±0.52*△ 5789.41±77.49*△高剂量组 10 12.42±1.03*△▲ 170.34±12.18*△▲ 15.47±0.48*△▲ 5178.82±53.29*△▲

4 各组大鼠的血清氧化应激酶结果比较

结果表明，与假手术组相比较，各组大鼠心肌组织中的MDA含量明显增加，SOD含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）。与模型组相比较，调脾护心方高、低剂量组能显著增加心肌组织中的SOD含量，降低心肌组织中的MDA含量，差异有统计学意义（P＜0.05或0.01），表明调脾护心方能降低心肌过氧化损伤，提高心肌组织抗氧化能力。调脾护心方高、低剂量组组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），表明调脾护心方可提高心肌抗氧化能力，且存在药物剂量关系。见表3。

表3 各组大鼠的血清SOD、MDA水平比较（）

表3 各组大鼠的血清SOD、MDA水平比较（）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与调脾护心方低剂量组比较，▲P＜0.05。

组别 例数 SOD/U·mL-1 MDA/nmol·mL-1假手术组 9 115.90±3.71 3.64±0.38模型组 8 87.52±3.70** 8.07±0.76**低剂量组 9 105.00±3.10**△ 5.26±0.29*△高剂量组 10 107.86±3.49*△▲ 5.22±0.34*△△▲

讨 论

图4 各组大鼠心肌HE染色结果比较

MIRI的特点主要为梗死心肌恢复血流再灌注时，此时梗死区域心肌组织缺血缺氧状态非但没有改善反而加重并伴有血清心肌酶活性升高，同时心肌组织中出现大量氧自由基，促发氧化应激反应，破坏心肌细胞膜，损害心肌组织，导致大量心肌细胞死亡，严重影响心功能及预后[10]。本研究结果显示模型组大鼠SOD活性降低，LDH、cTnI、AST、CK-MB、MDA水平升高，且心肌组织出现明显病理性损伤，提示MIRI大鼠模型制备成功。

MIRI在中医学归属于“胸痹”、“真心痛”、“心悸”的范畴，基本病机是本虚标实，虚者为气血阴阳亏损，心失所养，实者多由痰浊扰心、心脉瘀阻。治疗上常以急则治其标为原则，以活血化瘀、化痰通络佐以健脾养心之法[11]。孙思邈《备急千金要方》：“心劳病者，健脾以益之，脾旺则感于心矣”，提出健脾养心之法，后世医家在其基础上充实发挥，从脾论治胸痹病，收效颇丰[12]。调脾护心方由经方归脾汤和酸枣仁汤加减化裁而来，主要有陈皮、白术、茯苓、酸枣仁、灸远志、灸甘草、广木香、蒲公英等，方中酸枣仁补血养肝，白术健脾益气，茯苓、远志安神宁心，木香、陈皮、蒲公英理气和胃、燥湿醒脾，甘草为补气旺脾，调和诸药。诸药合用，全方行益气健脾，养心安神之功。现代药理学认为：白术、蒲公英、木香可抗血小板聚集，阻止血栓形成[13，14，15]。酸枣仁、远志能够改善心肌缺血，缩小心梗面积[16，17]。茯苓能提高氧化应激酶活性，减少自由基对心肌细胞的损伤，改善心功能[18]。陈皮能够改善冠脉血流，纠正心肌缺血缺氧状态，同时可减轻动脉粥样硬化，并具有抗血栓及抗氧化的作用[19]。

本实验研究发现，调脾护心方处理后MIRI大鼠SOD活性升高，LDH、cTnI、AST、CK-MB、MDA水平降低，心肌组织病理损伤小于模型组，且高剂量调脾护心方较低剂量组作用更明显，表明调脾护心方可减轻缺血再灌注心肌损伤，提高心肌组织抗氧化、清除氧自由基能力，减少心肌组织病理损伤，对心肌缺血再灌注损伤有良好的保护作用。但调脾护心方对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用具体机制尚不清楚，需进一步研究探索，以期为临床实践提供参考证据。