重组人5型腺病毒注射液局部瘤内注射治疗晚期肝癌的临床研究

陆吉麟 张浩 石伟 崔小红 岳增辉 王永勇 伊萌

[摘要] 目的 探討重组人5型腺病毒注射液局部瘤内注射治疗晚期肝癌的临床疗效及安全性。 方法 选择2009年1月至2013年1月来自复旦大学附属华山医院的80例晚期肝癌患者，分为对照组（n=40）和观察组（n=40），对照组患者只给予顺铂及5-氟尿嘧啶化疗，观察组患者在化疗基础上联合B超引导下经皮瘤内注射重组人5型腺病毒注射液，连续使用两个周期。比较两组患者肿瘤客观有效率、肿瘤进展时间及不良反应。 结果 观察组的客观有效率为22.50%，高于对照组的5.00%，差异有统计学意义（P<0.05）。观察组的平均肿瘤进展时间为（11.93±2.54）周，高于对照组的（8.06±2.21）周，差异有统计学意义（P<0.05）。局部瘤内注射后48 h观察组血液中IFN-γ、IL-1α、IL-6及TNF-α显著高于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05）。两组患者治疗后ALT、AST、ALP、TBIL及AFP指标均有所下降，而观察组下降幅度大于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。观察组患者不良反应主要为发热、局部反应及流感样症状，均为Ⅰ/Ⅱ级。观察组患者生活质量提高率为55.00%，高于对照组的22.50%，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 晚期肝癌患者在化疗基础上局部瘤内注射重组人5型腺病毒注射液，可提高客观有效率和患者生存期，且安全性及耐受性好。

[关键词] 肝癌;腺病毒;重组人5型腺病毒;基因疗法

[中图分类号] R738.6;R730.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）12-0010-06

Clinical research on topical intratumoral injection of recombinant human adenovirus type 5 in the treatment of advanced liver cancer

LU Jilin1   ZHANG Hao1   SHI Wei1   CUI Xiaohong2   YUE Zenghui2   WANG Yongyong2   YI Meng3

1.Department of General Surgery， Huashan Hospital Affiliated to Fudan University， Shanghai   200050， China; 2.Department of General Surgery， Shanghai Electric Power Hospital， Shanghai 200031， China; 3.Shanghai Sunway Biotech Co.，LTD， Shanghai   200052， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical efficacy and safety of intratumoral injection of recombinant human adenovirus type 5 in the treatment of advanced liver cancer. Methods A total of 80 patients with advanced liver cancer admitted to Huashan Hospital Affiliated to Fudan University from January 2009 to January 2013 were selected， and they were divided into the control group（n=40） and the observation group （n=40）. The patients in the control group were only treated with cisplatin and fluorouracil chemotherapy， while those in the observation group were treated with recombinant human adenovirus type 5 injection on the basis of chemotherapy combined with B-ultrasound guided percutaneous injection for two consecutive cycles. The objective efficacy rate， tumor progression time and adverse reactions （ADRs） of the two groups of tumors were compared. Results The objective efficacy rate in the observation group was 22.50%， which was higher than that of 5.00% in the control group， with statistically significant difference （P<0.05）. The tumor progression time in the observation group was （11.93±2.54） weeks， which was higher than that of （8.06±2.21） weeks in the control group，with statistically significant difference（P<0.05）. The blood levels of IFN-γ， IL-1α， IL-6 and TNF-α in the observation group 48 h after topical intratumoral injection were significantly higher than those before injection（P<0.05）. After treatment， the index levels of ALT， AST， ALP， TBIL and AFP all decreased in both groups， while the decrease in the observation group was greater than that in the control group， with statistically significant difference（P<0.05）. The main ADRs in the observation group were fever， topical reactions and influenza like symptoms， all of which were grade Ⅰ/Ⅱ. The improvement rate of quality of life in the observation group was 55.00%， which was higher than that of 22.50% in the control group，with statistically significant difference（P<0.05）. Conclusion Topical intratumoral injection of recombinant human adenovirus type 5 on the basis of chemotherapy for patients with advanced liver cancer can improve the objective efficacy rate and survival time of patients， with good safety and tolerance.

[Key words] Liver cancer; Adenovirus; Recombinant human adenovirus type 5; Gene therapy

肝癌具有极高的发病率和死亡率，是严重威胁我国人民健康的恶性疾病之一[1]。手术切除是肝癌首选的治疗手段[2]。但是，我国的肝癌患者多合并有不同程度的肝硬化，很多患者因此失去了手术机会。溶瘤腺病毒注射作为一种肿瘤的基因治疗方法日益受到关注[3-4]。重组人5型腺病毒注射液（商品名：安柯瑞）是全球第一个成功上市的溶瘤病毒药物。重组人5型腺病毒注射液是利用基因工程技术删除人5型腺病毒E1B-55kD和E3区部分基因片段而获得的一种溶瘤性腺病毒。重组人5型腺病毒注射液用于晚期肝癌治疗国内尚无报道。本院进行临床试验，分析在化疗基础上联合重组人5型腺病毒对肝癌的治疗效果，并分析其有效性和安全性，以期为临床治疗提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2009年1月至2013年1月于复旦大学附属华山医院住院治疗的80例原发性肝癌晚期患者为研究对象，其中男47例，女33例。根据患者是否接受重组人5型腺病毒注射液局部瘤内注射治疗，将其分为对照组与观察组，每组各40例。纳入标准：①年龄18～70岁，经病理组织确诊的原发性肝细胞癌者[5];②预计生存期>6个月者;③无肝、肾功能严重障碍（Child A和B级患者）、无门静脉主干完全阻塞、肿瘤占据率<70%者。除此之外，观察组患者尚具备以下标准[5]：①经病理组织学确诊的，易于进行B超引导下经皮肝穿刺肿瘤内注射操作的肝癌者;②受试者体力状况KPS评分≥60分者;③至少有一个适合进行瘤内注射操作的可评价病灶者。排除标准[5]：①全身情况差，肝功明显受损者（胆红素>3倍正常值上限、血清白蛋白<30 g/L）;②妊娠及哺乳期妇女;③有明显的重要脏器功能受损及血液系统疾病者;④合并其他恶性肿瘤者。观察组患者尚需排除：①有生物制剂过敏史者;②正在使用抗病毒药物者及在1个月内使用过免疫制剂者。基线时，两组患者在性别、年龄、Child分期等临床资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性 。见表1。本研究所有患者均签署知情同意书，且本研究符合赫尔辛基宣言，并获得复旦大学附属华山医院医学伦理委员会的批准。

1.2 方法

对照组患者静脉注射5-氟尿嘧啶500 mg/m2（上海旭东海普药业有限公司，国药准字H31020593，批号：00000693，规格：250 mg/10 mL）和顺铂 20 mg/m2（齐鲁制药有限公司，国药准字H20023461，批号：00001298，规格：20 mg）;观察组患者在对照组化疗方法的基础上，在B超引导下将5支重组人5型腺病毒注射液（上海三维生物技术有限公司，国药准字S20060027，规格：5.0×1011 VP/0.5 mL/支）生理盐水稀释后瘤内多点注射，剂量为2.5×1012 VP/d，以14 d为一个周期，连续使用2个周期。

1.3 观察指标及评价标准

①试验前检查：患者KPS评分（Karnofsky score，KPS）、生命体征、血常规、尿常规、血生化、凝血功能、细胞因子、肿瘤标志物、心电图、肝脏B超/计算机断层扫描（Computed tomography，CT）/磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）检查。②试验期间检查：生命体征、用药后的体温监测及其他不良反应的观察、肿瘤大小监测、肿瘤标志物、细胞因子、病毒定量PCR检测。对所有患者进行随访，在2个周期治疗结束后及之后每个月进行随访直至死亡。比较两组肿瘤客观有效率、肿瘤进展时间及不良反应。两组疗效结束后4周评定肿瘤客观有效率，根据《实体肿瘤客观疗效评定标准》[6]评定疗效，分为完全缓解（Complete remission，CR）、部分缓解（Partial remission，PR）、无变化（No change，NC）和进展（Progressive diseas，PD），其中CR+PR为客观有效率。不良反应按NCI毒性分为Ⅰ～Ⅳ级。采用Karnofsky评分[7]评价治疗4周后患者的生活质量，增加≥10分为提高，减少≥10分为下降，增加或下降不足10分为稳定。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，肿瘤进展时间用Kaplan-Meier检验行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者客观有效率及肿瘤进展时间比较

观察组的客观有效率（CR+PR）显著高于对照组（22.50% vs. 5.00%），差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。观察组与对照组平均肿瘤进展时间分别为（11.93±2.54）周与（8.06±2.21）周，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 两组患者治疗前后病毒数量及细胞因子比较

治疗前和治疗后48 h，对照组患者血液中病毒数量及细胞因子干扰素-γ（Interferon γ，IFN-γ）、白细胞介素（Interleukin，IL）-1α、IL-6和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）-α的水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前相比，观察组患者在局部瘤内注射重组人5型腺病毒注射液48 h后血液中病毒数量、IFN-γ、IL-1α、IL-6和TNF-α显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）。此外，治疗后48 h，观察组患者的病毒数量、IFN-γ、IL-1α、IL-6和TNF-α显著高于对照组，差异有統计学意义（P<0.05）。见表3。

2.3 重组人5型腺病毒注射液对患者肝功能和肿瘤标志物的影响

治疗后48 h，两组患者谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、总胆红素（Total Bilirubin，TBIL）及甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein，AFP）指标较治疗前均有所下降，差异有统计学意义（P<0.05）;但观察组的下降幅度大于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 注射重组人5型腺病毒注射液后对患者肿瘤体积变化的影响

观察组患者治疗2个月后复查CT，有28例患者肿瘤内出现不同程度坏死，肿瘤体积缩小，计算机三维体积重建结果显示，治疗前后缩小范围为17.83%～38.92%，差异有统计学意义（P<0.05）。而对照组患者治疗2个月后复查CT，仅有4例患者肿瘤内出现不同程度坏死，肿瘤体积缩小范围为4.53%～7.35%，差异无统计学意义（P>0.05）。且治疗2个月后，观察组患者肿瘤体积缩小范围显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.5观察组不良反应发生情况

观察组患者不良反应主要为发热19例（47.50%）、局部反应2例（5.00%），持续时间<24 h、流感样症状5例（12.50%），均为Ⅰ/Ⅱ级，患者均可耐受，多数可自行缓解，体温较高且患者无法耐受时予以对症治疗。

2.6 两组患者生存率及生活质量比较

与对照组相比，观察组患者生存率显著增加（P<0.05）。见封三图2。且观察组患者生活质量提高率为55.00%，高于对照组的22.50%，差异有统计学意义（P<0.05）。

3讨论

基因治疗作为一种新的治疗方式显示出了初步疗效，且可以延长恶性肿瘤患者的生存期，溶瘤性腺病毒治疗是基因治疗中最有前途的治疗方法之一，通过溶瘤性腺病毒局部注射，病毒可感染肿瘤组织并复制，最终溶解肿瘤细胞[8]。目前腺病毒依据血清分型分为51个不同亚型，均为无包膜病毒，其线性双链DNA约有36 kB，包括早期基因E1-E4及晚期基因L1-L5。溶瘤性腺病毒可用于基因治疗肿瘤的主要原因为[9]：①溶瘤性腺病毒的生物学特性适用于基因治疗;②对人类相对较低的致病性;③可同时感染分裂细胞及休眠细胞;④有能力容纳大的基因负荷;⑤由于病毒很少整合入宿主细胞，发生插入诱变的风险较低;⑥操作简单即可获得较高的病毒产量。

本研究主要探讨在化疗基础上联合局部瘤内注射重组人5型腺病毒对肝癌的治疗效果和安全性。实时定量PCR结果显示，在重组人5型腺病毒注射液局部瘤内注射48 h后，病毒数量显著扩增，使其生物学功效得以很好地发挥。观察组患者客观有效率显著高于对照组，平均肿瘤进展时间也显著延长。重组人5型腺病毒注射液是利用基因工程技术删除人5型腺病毒E1B-55kD和E3区部分基因片段，能在p53功能缺陷的肿瘤细胞中选择性复制，具有复制依赖性细胞毒作用，在一定剂量范围内对p53功能缺陷的肿瘤具有明显的抗肿瘤活性，对正常细胞则无明显毒性作用。p53为重要的抑癌基因，可在细胞核转录的同时促发细胞凋亡，此外还可抑制肿瘤细胞的DNA修复和抗凋亡功能[10-11]。p53蛋白是细胞生长的负性调节剂，可阻止细胞周期中G1期细胞进入到S期，使损伤的DNA或染色体有时间修复。E1B-55kD蛋白可与p53蛋白结合，抑制p53对病毒的清除。重组人5型腺病毒注射液由于删除了E1B-55kD而在p53正常的肝细胞中无法复制;而在p53基因突变的肿瘤中，病毒由于無p53基因的抑制作用而大量复制并裂解杀伤细胞，同时释放大量子代病毒再感染其他细胞，从而发挥靶向杀伤的抗肿瘤作用。最新研究认为，溶瘤病毒除了p53途径之外，还可能与晚期RNA能否转录出细胞核相关，该研究认为晚期病毒RNA出核与E1B-55kD相关，由于溶瘤病毒删除E1B-55kD，从而限制溶瘤病毒晚期RNA出核，使其无法在正常细胞中复制，所以这一过程与p53途径无关。而肿瘤细胞由于遗传的不稳定性，可以弥补E1B-55kD所起的作用，即使病毒删除了E1B-55kD，病毒晚期mRNA的出核也不受影响，从而可以顺利地完成晚期蛋白的翻译、合成和装配。E3片段的删除可使肿瘤抗原信息通过树突状细胞递呈给人体免疫系统，激活T淋巴细胞，发挥全身性抗肿瘤效应[12]。E3片段与机体宿主免疫抑制相关，宿主免疫可促进病毒在肿瘤细胞中的复制和扩散[13-14]。病毒感染可激活感染病毒的肿瘤细胞宿主免疫反应，协助宿主免疫系统识别肿瘤细胞。同时由于肿瘤晚期，其他部位发生转移非常常见，某些病灶可能无法进行肿瘤局部注射，此时宿主免疫系统的激活则可以使这部分患者治疗获益。目前，该病毒已在其他相关领域，如体表实体肿瘤、肺癌、头颈部及胰腺癌等各期临床研究中显示出其优良的抗肿瘤效应和安全性[15-19]。而本研究结果提示，在化疗的基础上联合局部瘤内注射重组人5型腺病毒可以有效诱导肿瘤细胞坏死，从而提高治疗效果。

观察组大部分患者出现了TNF-α和IFN-γ等化疗增敏细胞因子的升高，IFN-γ、IL-1α、IL-6及TNF-α等炎症因子水平的升高可以降低肿瘤细胞的免疫逃避效应，从而发挥全身性的抗肿瘤效应。这些细胞因子之间、细胞因子和化疗之间、细胞因子与高体温之间均可发生协同作用，更有利于进一步杀死肿瘤细胞[20]。药物安全性和不良反应是两个最值得注意的问题。本研究结果显示，密切关注治疗和随访期间的不良反应，本研究中观察组不良反应均为Ⅰ/Ⅱ级，患者均可耐受，多数可自行缓解，且生活质量显著优于对照组。可能是由于重组人5型腺病毒是一种修饰的溶瘤腺病毒，其中的E1B（E1B-55 kD）基因部分已被删除，在正常细胞中的复制能力受到抑制，从而提高了安全性[21]。

綜上所述，晚期肝癌患者在化疗基础上局部瘤内注射重组人5型腺病毒注射液，可提高客观有效率和患者生存期，且安全性及耐受性好。

[参考文献]

[1] 王伟强，张伟，李仁涛，等. 单发大肝癌患者肝切除术后长期生存影响因素[J]. 中华肝胆外科杂志，2018，24（5）：299-303.

[2] Swaid F，Geller DA. Minimally invasive primary liver cancer surgery[J]. Surg Oncol Clin N Am，2019，28（2）：215-227.

[3] Huang H，Liu Y，Liao W，et al. Oncolytic adenovirus programmed by synthetic gene circuit for cancer immunotherapy[J]. Nat Commun，2019，10（1）：4801-4809.

[4] García M，Moreno R，Gil-Martin M，et al. A phase 1 trial of oncolytic adenovirus ICOVIR-5 administered intravenously to cutaneous and uveal melanoma patients[J]. Hum Gene Ther，2019，30（3）：352-364.

[5] 中国抗癌协会肝癌专业委员会，中华医学会肝病学分会肝癌学组，中国抗癌协会病理专业委员会，等. 原发性肝癌规范化病理诊断指南（2015年版）[J]. 解放军医学杂志，2015， 40（11）：145-151.

[6] 张志强，马怡，郑爽，等.实体肿瘤治疗效果评价标准的研究进展[J].中国临床实用医学，2019，10（2）：71-73.

[7] Thuluvath PJ，Thuluvath AJ，Savva Y. Karnofsky performance status before and after liver transplantation predicts graft and patient survival[J].J Hepatol，2018，69（4）：818-825.

[8] Lang FF，Conrad C，Gomez-Manzano C， et al. Phase Ⅰ study of DNX-2401（Delta-24-RGD） oncolytic adenovirus：Replication and immunotherapeutic effects in recurrent malignant glioma[J]. J Clin Oncol，2018，36（14）：1419-1427.

[9] Goradel NH， Mohajel N， Malekshahi ZV，et al. Oncolytic adenovirus：A tool for cancer therapy in combination with other therapeutic approaches[J]. J Cell Physiol，2019，234（6）：8636-8646.

[10] He X，Liu J，Yang C，et al. 5/35 Fiber-modified conditionally replicative adenovirus armed with p53 shows increased tumor-suppressing capacity to breast cancer cells[J]. Hum Gene Ther， 2011，22（3）：283-292.

[11] Martins CP， Brown-Swigart L，Evan GI. Modeling the therapeutic efficacy of p53 restoration in tumors[J]. Cell，2006，127（7）：1323-1334.

[12] Ko EJ，Hait SH，Enyindah-Asonye G，et al. Replicating adenovirus-SIV immunization of rhesus macaques induces mucosal dendritic cell activation and function leading to rectal immune responses[J].Front Immunol，2019， 10（1）：779-782.

[13] Spurrell E，Gangeswaran R，Wang P，et al. STAT1 interaction with E3-14.7K in monocytes affects the efficacy of oncolytic adenovirus[J].J Virol，2017，91（20）：670-687.

[14] He Q，Liu Y，Zou Q，et al.Transarterial injection of H101 in combination with chemoembolization overcomes recurrent hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol，2011，17（18）：2353-2355.

[15] Abbas BM，El-Mogy MA，Haj-Ahmad Y.Oncolytic E1B 55KDa-deleted adenovirus replication is independent of p53 levels in cancer cells[J].Cell Mol Biol，2017，63（7）： 1-11.

[16] Lv SQ，Ye ZL，Liu PY，et al.11R-P53 and GM-CSF Expressing oncolytic adenovirus target cancer stem cells with enhanced synergistic activity[J].J Cancer，2017，8（2）：199-206.

[17] Zhang WW，Li L，Li D，et al.The first approved gene therapy product for cancer Ad-p53（Gendicine）：12 years in the clinic[J].Hum Gene Ther，2018，29（2）：160-179.

[18] Salzwedel AO，Han J，LaRocca CJ，et al.Combination of interferon-expressing oncolytic adenovirus with chemotherapy and radiation is highly synergistic in hamster model of pancreatic cancer[J].Oncotarget，2018， 9（26）：18041-18052.

[19] 肖斌，金震東，李兆申.瘤内注射重组溶瘤病毒联合吉西他滨化疗治疗中晚期胰腺癌19例疗效观察[J].中华胰腺病杂志，2011，11（3）：163-166.

[20] Jewett A，Kos J，Kaur K，et al.Natural killer cells： Diverse functions in tumor immunity and defects in pre-neoplastic and neoplastic stages of tumorigenesis[J].Mol Ther Oncolytics，2019，16（1）：41-52.

[21] Vasey PA，Shulman LN，Campos S，et al.Phase I trial of intraperitoneal injection of the E1B-55-kd-gene-deleted adenovirus ONYX-015（dl1520）given on days 1 through 5 every 3 weeks in patients with recurrent/refractory epithelial ovarian cancer[J].J Clin Oncol，2002，20（6）：1562-1569.

（收稿日期：2020-12-03）