禽活疫苗中网状内皮组织增生症病毒污染的检测方法比较

李雪莲

摘  要：本研究随机抽取4种市售活疫苗，利用RT-PCR法、IFA检测法和SPF鸡检查法，检测活疫苗中的禽网状内皮组织增生症病毒的污染，比较三种检测方法的优劣以找到更好检测的方法。试验结果表明，RT-PCR法虽然方便、快捷，但RT-PCR法检测会产生假阳性，影响结果的判定;SPF鸡检查法操作简单结果可靠，但该方法试验周期较长，成本高;IFA检测法与传统鸡检查法相比具有快速、准确、成本低的优点，利于推广应用。

关键词：IFA检测法;RT-PCR;SPF鸡检查法;禽网状内皮组织增生症病毒;家禽活疫苗

禽网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis，RE）是指由反转录病毒科网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）引起的禽类以急性网状细胞肿瘤、生长抑制综合征、淋巴组织及其他组织慢性肿瘤形成为特征的一群病理综合征[1-2]。由于REV可以通过种蛋垂直传播，如果使用污染有REV的鸡胚生产的疫苗会造成疫苗中污染REV，这是REV独特的传播途径之一[3]。REV是活疫苗污染中常见的一种外源病毒，当被污染的疫苗免疫鸡群后可引起雏鸡免疫抑制和矮小综合征，从而给家禽养殖业造成巨大经济损失。国内外均有因REV污染疫苗引起严重损失的案例和报道[4-6]。对禽源活疫苗进行REV污染检测，确保疫苗使用的有效性和安全性，是防止REV传播的重要手段。

目前对疫苗中REV污染的检测，我国应用方法主要包括细胞培养法和接种SPF鸡检查法，其中接种SPF鸡检查法被认为是经典的“金标准”，检测结果相对可靠容易判定，但缺点是检测周期长。通常情况下，家禽活疫苗中REV等外源病毒的污染需要用非常灵敏、特异性强、检测周期短的方法来进行检测。RT-PCR法、IFA检测法和SPF鸡检查法，目的就是为了找到更为合理的检测家禽活疫苗中禽网状内皮组织增生症病毒的检测方法。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  主要试剂  鸡新城疫病毒（La Sota株）阳性血清、鸡传染性法氏囊病阳性血清、REV特异性抗体，均购自中国兽医药品监察所;FITC标记的兔抗鸡IgG，购自Sigma公司;网状内皮组织增生症病毒（REV），山东农业大学馈赠;REV抗体ELISA检测试剂盒，购自美国IDEXX公司。

1.1.2  疫苗  鸡新城疫活疫苗（La Sota株）、鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）、鸡传染性法氏囊活疫苗（B87株）和鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗（La Sota株+QXL87株）。

1.1.3  试验动物  SPF鸡胚和SPF鸡均购自勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。

1.2  方法

1.2.1  RT-PCR检测法

1.2.1.1  样品处理  将疫苗分别用2 mL灭菌0.01 mol/L PBS还原。

1.2.1.2  引物设计  根据GenBank中登录的REV群特异性抗原env的基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性引物，由华大基因合成，扩增目的基因片段长度为476 bp。引物序列如下：

上游引物：5'- GCGTTAAGGACCTGGTGAGTAGC -3';

下游引物：5'- GGGATTTAGACAACAGTGGGAGT -3'。

1.2.1.3  核酸提取与凝胶电泳  按照艾科瑞生物公司一步法（RT-PCR）试剂盒说明书操作，进行核酸提取与基因扩增，采用凝胶电泳鉴定。

反应体系为20 μL：2×One Step Mix 10 μL，One Step Enzyme Mix 1 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 5 μL。

反应条件：50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，进行35个循环，最后72 ℃延伸5 min。

扩增产物电泳条件：取5 μL PCR扩增产物，用1%的琼脂糖凝胶在120 V电泳。

1.2.2  IFA检测法

1.2.2.1  制备鸡胚成纤维细胞（CEF）  参照《中华人民共和国兽药典》附录方法制备[7]。

1.2.2.2  疫苗的处理及接种  将鸡新城疫活疫苗（La Sota株）和鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗（La Sota株+QXL87株）分别用无血清的M-199培养液溶解，使最终为200羽份/0.8 mL，以4 ℃、10000 g離心10 min。取离心后的上清液与等量的鸡新城疫病毒特异性抗血清混匀，37 ℃中和60 min，取中和液1.6 mL接种CEF细胞。

将鸡传染性法氏囊活疫苗（B87株）用无血清的M-199培养液溶解，使最终为500羽份/2 mL，以4 ℃、10000 g离心10 min。取离心后的上清液与等量的鸡传染性法氏囊病病毒特异性抗血清混匀，37 ℃中和60 min，取中和液4.0 mL接种CEF细胞。

将鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）用无血清的M-199培养液溶解，使最终为500羽份/2 mL，以4 ℃、10000 g离心10 min。取离心后的上清液2.0 mL接种CEF细胞[7]。

1.2.2.3  病毒对照  将鸡网状内皮组织增生症病毒（REV）稀释至10 TCID50/mL，取1.0 mL接种至CEF单层作为阳性对照。

1.2.2.4  细胞培养的传代  细胞培养7 d后，按常规方法消化、收获细胞，将其中1/10细胞用2.0 mL含3%新生牛血清的M-199培养液悬浮，接种4孔48孔细胞培养板，每孔接种0.5 mL，37 ℃继续培养5 d，进行荧光染色，在倒置荧光显微镜下观察。

1.2.2.5  荧光染色  采用间接免疫荧光试验（IFA）进行，具体方法参照2015年版《中华人民共和国兽药典》三部附录3304禽网状内皮组织增生症病毒检验法进行[7]。

1.2.3  SPF鸡检查法

1.2.3.1  样品处理  每瓶样品加入5 mL无菌PBS溶解，同一样品取3瓶疫苗混合均匀作为待检样品，最终浓度为20羽份/0.1 mL。

1.2.3.2  免疫接种  适于接种本疫苗日龄的SPF鸡20只/组，每只鸡同时点眼、滴鼻接种10羽份疫苗，肌肉注射100羽份疫苗;21 d后，按上述方法和剂量重复接种1次。第1次接种后42 d采血。采用商品化的IDEXX网状内皮组织增生症抗体检测试剂盒，检测REV特异性抗体[6]。S/P值=（血清样品的OD650nm-阴性对照的OD650nm）/（阳性对照的OD650nm-阴性对照的OD650nm）。

2  结果与分析

2.1  RT-PCR检测法  检测结果见表1。

PCR产物进行琼脂糖电泳，凝胶成像系统显示REV病毒阳性对照出现470 bp亮度很高的特异性扩增条带，与预期大小一致，阴性对照和四种被检活疫苗均未出现特异性扩增产物，检测结果说明该疫苗样品没有污染禽网状内皮组织增生症病毒。

2.2  IFA检测法  采用间接免疫荧光试验（IFA）分别检测不同活疫苗样品中细胞培养分离的REV抗原，结果见表1和图2。

通过表1和图2检测结果可知，阳性对照的细胞形态轮廓清晰，出现特异性绿色荧光，荧光聚集在胞浆中，且荧光较亮。四种活疫苗样品和阴性对照中均未出现特异性绿色荧光，说明四种疫苗样品没有污染禽网状内皮组织增生症病毒。

2.3  SPF鸡检查法  使用美国IDEXX公司REV抗体ELISA检测试剂盒，检测不同疫苗样品免疫的20只SPF鸡血清抗体，结果见表2。

检测结果显示四种疫苗免疫组及对照组血清REV抗体S/P值范围在-0.020～0.200之间，均小于0.5，检测结果全部判定为阴性，即四种疫苗样品没有污染禽网状内皮组织增生症病毒。

3  讨论与结论

PCR法不需要对样品进行任何处理，直接从样本中提取DNA，当日即可对样品做出定性的检测，结果可疑当天便可重检，所以PCR法具有快捷、方便、结果判定更为直观等优点;RT-PCR是反转录与PCR反应在同一反应体系进行，大大提高了反应效率。PCR和RT-PCR均可用于疫苗中REV污染情况的监测。庄金秋等[8]用REV的LTR基因序列设计引物建立了PCR方法用于疫苗污染REV的检测，经与间接免疫荧光法进行同步比较试验，结果吻合性较高。Award等[9]用PCR方法在鸡痘病毒疫苗样品中检测到REV核酸阳性。葛兆宏等[10]和毕研丽等[11]分别建立RT-PCR法用于REV的检测。为了提高检测的敏感性和特异性，Luan等[12]利用建立实时荧光定量PCR方法，检测到疫苗中有REV污染。黄小洁[13]运用建立的实时荧光PCR方法对17批禽用活疫苗进行检测，并与间接免疫荧光法（IFA）进行同步比较试验，结果两者符合率为100%。但要注意不少情况下REV的基因组可以部分或全部整合到宿主细胞或其它病毒的基因组中，这时再用PCR方法检测就会产生假阳性结果。

根据《中华人民共和国兽药典》中外源病毒检验要求，我国禽源制品的外源病毒检验主要是鸡胚检查法、细胞检查法和鸡检查法。通常情况下，可采用鸡胚检查法和细胞检查法进行外源病毒检验，如检验无结果或结果可疑时，用鸡检查法进行检验[7]。这一方法操作简单、结果可靠，也更具说服力，不会受到其它因素的干扰，但该方法缺点在于试验周期较长、成本高且需要具有SPF鸡的饲养条件方可开展检测。

虽然IFA检测法需要对疫苗样品进行中和处理（不同种类疫苗处理方法不同），接种CEF传代，再进行IFA检测，检测需要荧光显微镜，需要具有中和效价较高的特异性REV阳性血清和FITC标记的兔抗鸡IgG，但是IFA检测方法与传统鸡检查法相比具有检测周期短、操作简便、不需要试验动物、成本低等优点;而且IFA检测方法具有较高的敏感性，该方法的建立进一步完善了禽用活疫苗外源病毒的检验体系，为有效防控禽用活疫苗污染外源病毒提供了更可行有效的检验手段。孫淼等[14]用间接免疫荧光法（IFA）对鸡痘病毒活疫苗进行了检验，疫苗REV检测为阳性，随后按鸡检查法进行外源病毒检验，结果两种方法对REV污染的检测结果的符合率为100%。李启红等[15]用IFA检测法对43批马立克氏病活疫苗进行检验，其中4批疫苗REV检测为阳性，用鸡检查法进行检验，结果表明两种检测方法完全符合。

总之，IFA检测方法是检测家禽活疫苗中禽网状内皮组织增生症病毒污染的行之有效的方法，与传统鸡检查法相比具有快速、准确、成本低的优点，更利于推广应用。

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