卵巢早衰患者血清TNF-α、TGF-β1水平及TNF-α基因308G/A位点多态性分析

杨贤慧，方霞，刘爱胜，施俊柱

(1.深圳市龙华区人民医院 检验科，深圳 518109；2.深圳市龙华区中心医院 检验科，深圳 518110)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)又称早绝经，是指曾经月经周期正常的女性在40岁前出现原因不明的卵巢功能衰竭，主要表现为卵巢萎缩性持续闭经，并伴有雌激素水平降低而促性腺激素水平升高[1-3]。POF病因十分复杂，发病机制目前尚未完全明确，多数认为POF发病与遗传、环境、精神、感染、代谢及自身免疫等诸多因素有关，其中遗传因素是POF发病的主要原因之一[4-5]。近年研究发现，POF发病与多个基因多个位点多态性有密切关系，TNF-α基因308G/A位点多态性就是其中之一，且其基因突变可影响某些细胞因子和蛋白的表达水平，从而参与POF疾病的发生和发展[6-8]。因此，本研究对深圳地区167例POF患者和120例非POF健康育龄妇女TNF-α基因308G/A位点多态性与TNF-α、TGF-β1水平之间的相关性进行了调查分析。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取2017年4月—2019年5月来深圳龙华区人民医院妇产中心就诊并确诊为POF患者167例，年龄(28.06±9.57)岁。纳入标准[7]：(1)年龄<40周岁，继发性闭经时间>6个月；(2)2次或以上血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)≥40 U/L或黄体生成素(LH)>30 U/L(间隔1个月以上)；(3)连续2次雌二醇(estradiol，E2)水平<91.5 pmol/L(2个月内)；(4)B超显示双侧卵巢萎缩，无卵泡发育[7]。排除因其他原因如染色体核型异常、自身免疫性疾病、盆腔手术史及放化疗史等卵巢损害的因素导致卵巢功能低下的患者。同时选择同期非POF健康育龄妇女120例，年龄(29.36±10.24)岁，均为因输卵管或男性不育因素而就诊的育龄期妇女，月经周期规律，激素水平、染色体核型、子宫及卵巢功能均正常，排除有卵巢手术史、放化疗史、其他自身免疫性疾病、激素水平紊乱史及重大疾病史的患者。确保两组妇女的年龄差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会同意批准，且所有患者及家属对研究内容知情并签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂ABI7500 PCR分析仪、Qubit4.0核酸蛋白定量仪由美国ABI公司提供；DNA提取试剂由深圳亚能生物技术有限公司提供；TNF-α和TGF-β1试剂盒由深圳市科润达生物工程有限公司提供；AE275全自动免疫分析仪由深圳爱康科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 清晨采用一次性采血针采集所有研究对象空腹静脉血2份，其中一份3～4 mL于无抗凝剂的干燥管内分离血清，用于TNF-α和TGF-β1水平测定；另一份2～3 mL于抗凝管内混匀，于-70 ℃冰箱内保存，用于DNA提取。

1.3.2 TNF-α、TGF-β1水平测定 采用ELISA检测血清TNF-α和TGF-β1水平，检测前对所有相关仪器进行保养和校正，所有操作均严格按照试剂盒、仪器说明书及科室SOP操作规程进行，由相同的专业人员进行成批检测，确保结果的准确性和可比性。

1.3.3 DNA提取 采用深圳亚能生物技术有限公司提供的全血基因组DNA提取试剂盒提取外周血白细胞中的DNA，所有操作均严格按照试剂盒及仪器说明书进行。提取后的DNA浓度和纯度采用核酸荧光蛋白定量仪进行检测，将符合要求的DNA标本置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.4TNF-α基因308G/A位点多态性分析 检测步骤为(1)引物设计：上游5＇-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3＇，下游5＇-TCCTCCCTGCTCCGATTCCCG-3＇。(2)PCR反应体系：总反应体系为25 μL，其中DNA模板5 μL，Go Tag混合酶12.5 μL(包括Taq DNA聚合酶，dNTP，10×PCR缓冲液)，正、反向引物各0.25 μL，加入无菌去离子水至25 μL后混匀。(3)PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共反复循环35次；72 ℃延伸10 min。(4)限制性酶切：取25 μL PCR扩增的产物，加入25 μL限制性内切酶NcoⅠ，1 μL的10×核苷酸缓冲液(nucleotide buffer，NEB)，0.1 μL的100×牛血清白蛋白，用无菌去离子水加至100 μL，混匀，于65 ℃水浴2 h。(5)电泳：取10 μL酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳后判读酶切结果。

1.3.5 判读标准 GG基因型，于87和20 bp 处出现2条电泳带；GA基因型，于107、87和20 bp处出现3条电泳带；AA基因型，仅于107 bp处出现1条电泳带。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验POF组和对照组患者TNF-α基因308G/A位点均检测出GG、GA和AA 3种基因型，2组的基因型频率经Hardy-Weinberg检验，均符合Hardy-Weinberg平衡，研究对象选择均符合随机抽样，具有样本代表性。

2.2 两组血清TNF-α、TGF-β1水平的比较POF组患者血清TNF-α和TGF-β1水平分别为(9.02±3.28)pg/mL和(197.24±18.75)pg/mL，明显低于对照组[(21.59±6.86)pg/mL和(463.69±62.54)pg/mL](t=3.872 5、4.972 1，均P<0.05)。

2.3 两组血清TNF-α基因308 G/A位点基因型及等位基因检出率的比较POF组患者血清TNF-α基因308G/A位点GG基因型及G等位基因检出率分别为85.03%和90.12%，明显高于对照组(62.50%和73.33%)(均P<0.05)。(表1)

表1 POF组与对照组TNF-α基因308 G/A位点基因型及等位基因检出率的比较

2.4 不同基因型POF患者血清TNF-α、TGF-β1水平的比较TNF-α基因308G/A位点GG基因型的POF患者血清TNF-α和TGF-β1水平分别为(8.24±3.06)pg/mL和(172.57±15.04)pg/mL，明显低于GA和AA基因型(均P<0.05)。(表2)

表2 不同基因型POF患者血清TNF-α、TGF-β1水平的比较

3 讨论

POF是指卵巢功能衰竭所致妇女40岁前出现原发性或继发性闭经，并伴有促性腺激素水平升高和雌激素水平降低的一种疾病，是女性卵巢常见疾病之一，全球发病率约为1%，我国为1%～3.8%，且呈逐年上升趋势[9-11]。POF常伴有潮热、多汗、面部潮红及性欲低下等一系列不同程度的低雌激素症状，是导致女性不孕的常见原因之一，严重影响患者生育能力、生活质量和家庭和谐[12-13]。但POF病因复杂，发病机制尚未明确，给POF治疗及预防带来了很大的挑战[14-15]。因此，加大POF发病机制及影响因素的深入和广泛的研究，极具必要性。

TNF-α主要是由内毒素激活的巨噬细胞、淋巴细胞及卵泡的颗粒细胞产生的一种重要炎性细胞因子，其可促使颗粒细胞表达主要MHC抗原，以致激活体液免疫和细胞免疫介导的抗卵巢自身免疫应答，引起卵泡破坏，导致卵巢早衰[16-17]。而TGF-β1是TGF-β超家族中的一个亚型，以自分泌或旁分泌的方式通过Smad蛋白家族广泛地表达于不同时期卵泡的颗粒细胞、卵母细胞及卵泡膜细胞，在卵泡的生长、发育、闭锁及卵细胞发育成熟等方面都发挥了重要的作用，与卵巢功能密切相关[18-19]。本研究结果显示，POF患者血清TNF-α和TGF-β1水平明显低于非POF育龄妇女(均P<0.05)，与有关文献报道一致[8，16，18-19]，TNF-α水平降低可能与其某些基因位点易突变有关，而TGF-β1水平降低可能与POF患者的卵巢组织萎缩、颗粒细胞减少，甚至消失有关。

POF是一种复杂性遗传性疾病，与多种基因突变有关，但其遗传机制仍不清楚[20-22]。有研究发现，TNF-α基因启动子区的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)突变可影响TNF的产生，从而使不同个体之间TNF-α水平出现明显差异，并参与多种疾病的发生和发展[8，16]。本研究结果显示，深圳地区POF患者TNF-α基因308G/A位点GG基因型及G等位基因检出率明显高于非POF人群(均P<0.05)，这表明TNF-α基因308G/A位点SNP突变可能与POF发病有关，与有关报道一致[8]。同时本研究结果还显示，携带GG基因型的POF患者TNF-α和TGF-β1水平明显低于其他基因型(均P<0.05)，这可能与TNF-α基因308G/A位点SNP突变直接或间接从转录水平上影响TNF-α和TGF-β1分泌等因素有关，具体作用机制有待进一步深入研究。

综上所述，POF患者TNF-α和TGF-β1水平明显降低，而TNF-α基因308G/A位点GG基因型及G等位基因检出率明显升高，且不同基因型POF患者TNF-α和TGF-β1水平之间存在很大差异。由此可见，TNF-α基因308G/A位点的SNP可能与深圳地区POF发病有密切关系，其中GG基因型可能是POF发病的易感危险遗传基因之一。