盐酸-壳聚糖絮凝耦合处理回收鲢鱼糜漂洗液中的肌浆蛋白

周文燕 ，黄琪琳，翁武银

1.华中农业大学食品科学技术学院，武汉 430070； 2.集美大学食品与生物工程学院，厦门 361013

鱼糜制品因其富含优质蛋白和氨基酸，具有极高的营养价值和细嫩的口感，在世界范围内广受欢迎，其需求量逐年在不断增加[1-4]。到2019年，我国水产加工品总量2 171.41万t，在海水加工产品中，鱼糜制品产量约139.40万t[5]。鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)产量高，价格低廉，肉质鲜嫩，是用于生产鱼糜的主要淡水鱼[6]。然而，在鱼糜生产过程中，需用大量水多次漂洗鱼肉以去除残留的血液、脂质、水溶性蛋白和肌膜等杂质[7]，一方面会使占鱼肉蛋白20%～40%的水溶性肌浆蛋白在漂洗过程中流失，造成资源的严重浪费[8-10]；另一方面产生了大量富含蛋白的漂洗废水需要进行处理，否则会造成水体的富营养化。因此，若能将鱼糜漂洗液中的肌浆蛋白充分回收，既能提升肌浆蛋白利用率和鱼制品的附加值，又能降低漂洗废水中的有机污染物，降低处理成本，从而产生良好的经济价值和环境效益。

壳聚糖是一种直链型天然高分子聚合物，其主链含有丰富的氨基，在酸性介质中会质子化，表现为典型的阳离子聚电解质特征，赋予壳聚糖良好的絮凝性能[11-13]。此外，壳聚糖还兼具良好的生物相容性和可降解性，使其在废水处理中得到广泛的使用[14]。然而，壳聚糖在中性或碱性水溶液中的溶解性差，阻碍了其使用[15-16]，因此，单独采用壳聚糖絮凝鱼糜漂洗液中的肌浆蛋白，其回收率较低，仅在40%～50%[17-19]。近期热度较高的壳聚糖-海藻酸钠混合絮凝法[20-21]和等电点-絮凝剂复合法[22]用于絮凝鱼糜漂洗液蛋白，回收率有所提高，但过程相对复杂，工业化难度较高[23]。因此，如何提升壳聚糖对肌浆蛋白的絮凝效果，提高蛋白质回收率成为亟待解决的问题。本研究以提高肌浆蛋白回收率为目标，先调节pH再结合壳聚糖絮凝法回收鲢鱼糜漂洗液中肌浆蛋白，并通过单因素试验及Box-Bechnken中心组合设计优化肌浆蛋白的回收工艺，以期为肌浆蛋白的综合利用奠定基础，并为鱼糜生产中废水的净化处理提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲢，购于华中农业大学农贸市场；壳聚糖，北京酷来搏科技有限公司；牛血清蛋白标品，Sigma aldrich 公司；硫酸铜、酒石酸钾钠、碳酸钠、氢氧化钠、盐酸、福林酚试剂等均为国产分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

3205型食品调理机，德国博朗公司；HH-6型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；FJ-200型高速分散均质机，上海标本模型厂；Avanti J-26xp型高速冷冻离心机，贝克曼库尔特有限公司；台面式pH测试仪，美国奥利龙公司；UV-1750型紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

1.3 鱼糜漂洗液的制备

新鲜鲢敲晕，去头去尾去鱼皮去内脏，手工采肉，用调理机绞碎，称取鱼肉质量。取鱼肉以1∶3质量比加蒸馏水混合，经均质后在8 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，取上清液作为模拟鱼糜漂洗水，于4 ℃条件下储藏备用[24]。

1.4 单一壳聚糖絮凝法回收肌浆蛋白

取3支离心管，量取40 mL鱼糜漂洗液，依次与1.2 mL脱乙酰度为85%、90%、95%的1% 壳聚糖溶液混合。随后用3 mol/L NaOH溶液调节 pH值至7.0。20 ℃水浴90 min后，4 000 r/min离心10 min，取上清液测蛋白质质量浓度。

1.5 盐酸-壳聚糖絮凝耦合处理回收肌浆蛋白

取3支离心管，量取40 mL鱼糜漂洗液，依次与1.2 mL脱乙酰度为85%、90%、95%的1%壳聚糖溶液混合。事先采用3 mol/L HCl溶液调节pH值至3.0，随后用3 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0。20 ℃水浴90 min后，4 000 r/min离心10 min，取上清液测蛋白质质量浓度。

1.6 单因素试验

量取40 mL鱼糜漂洗液，与一定体积(0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL)壳聚糖溶液混合，事先采用3 mol/L HCl溶液调节pH值至3.0，随后用3 mol/L NaOH溶液调节pH值至一定值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)。放入一定温度(10、20、30、40、50、60、70 ℃)的水浴锅中静置一定时间(30、60、90、120、150、180、210 min)后，4 000 r/min离心10 min，取上清液测蛋白质质量浓度。

1.7 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，固定时间90 min，根据中心组合设计原理选择pH、壳聚糖用量、温度共3个因素进行响应面优化试验，确定回收肌浆蛋白的最佳工艺。

1.8 蛋白质回收率

蛋白质质量浓度按照福林酚法测定，回收率计算方法如下：

(1)

式(1)中，C0为原始漂洗液蛋白质质量浓度，mg/mL；C1为上清液蛋白质质量浓度，mg/mL。

1.9 化学需氧量(COD)的去除率

化学需氧量(COD)根据国家标准GB/T 15456-2019《工业循环冷却水中化学需氧量(COD)的测定 高锰酸盐指数法》[25]测定。COD去除率计算公式如下：

(2)

式(2)中，X0为原始漂洗液COD值，mg/L；X1为上清液COD值，mg/L。

1.10 数据统计与分析

运用Origin和Design-expert 8.0.6软件对数据进行分析和处理。

2 结果与分析

2.1 单一壳聚糖絮凝法回收肌浆蛋白

由图1可见，3种脱乙酰度壳聚糖回收肌浆蛋白的回收率依次为：95%脱乙酰度>90%脱乙酰度>85%脱乙酰度。脱乙酰度的增加会导致氨基增多，从而质子化后正电荷密度增加，提高了电荷中和效果，使得壳聚糖具有更佳的絮凝效果。因此，后续试验选择脱乙酰度为95%的壳聚糖。同时，通过单一的95%脱乙酰度壳聚糖絮凝法所得的肌浆蛋白质回收率为35%左右。

不同字母标注数值间差异显著(P<0.05),下同。There is significant difference between the groups marked with different letters (P<0.05),the same as below.

2.2 盐酸-壳聚糖絮凝耦合处理回收肌浆蛋白

盐酸-壳聚糖絮凝耦合处理回收肌浆蛋白结果如图2所示。盐酸处理能够显著提高壳聚糖作为单一絮凝剂时的絮凝效果，肌浆蛋白回收率高达81.54%。相较于单一壳聚糖絮凝法，蛋白质回收率提高了46.02%。由此可见，盐酸处理(pH3.0)在壳聚糖絮凝回收鱼糜漂洗液中蛋白时起着至关重要的作用，原因是经盐酸处理后壳聚糖质子化带正电荷，具有良好的水溶性，并与肌浆蛋白充分互溶；随后pH值升高，蛋白质分子逐渐解离成电负态，迅速与带正电的壳聚糖发生静电吸引而絮凝，共同沉降下来。

图2 盐酸-壳聚糖絮凝耦合处理对蛋白质回收率的影响Fig.2 Effect of hydrochloric acid-chitosan flocculation coupling treatment on protein recovery

2.3 不同pH值处理的肌浆蛋白回收率变化

pH值对蛋白质回收率的影响如图3所示。pH值对壳聚糖絮凝过程具有较为显著的影响。当pH值较低时，蛋白质回收率随pH值升高有明显上升趋势，并在pH 7.0处达到最大值。而随着pH值的进一步增加，肌浆蛋白回收率开始逐渐下降，这可能是由于蛋白质在碱性条件下溶解度提高所导致。

图3 pH值对蛋白质回收率的影响Fig.3 Effects of pH value on protein recovery

2.4 不同壳聚糖用量处理的肌浆蛋白回收率变化

壳聚糖用量对蛋白质回收率的影响如图4所示。当壳聚糖用量较低时，蛋白质回收率随絮凝剂用量的增加而逐渐上升，在壳聚糖用量为300 mg/L时，蛋白质回收率达到最大值，但壳聚糖用量过多会阻碍其余蛋白质的絮凝，从而导致蛋白絮凝回收率有逐渐下降趋势。

图4 壳聚糖用量对蛋白质回收率的影响Fig.4 Effects of chitosan dosage on protein recovery

2.5 不同温度处理的肌浆蛋白回收率变化

温度对蛋白质回收率的影响如图5所示。当温度在10～30 ℃时，回收率随温度先升高后下降，并在20 ℃时有一个相对较高的回收率。当温度超过30 ℃时，蛋白质回收率呈上升趋势。总体而言，温度高意味着较多的能耗，而换取的回收率增加幅度不大，因此，絮凝过程的最佳温度应选择20 ℃。

图5 温度对蛋白质回收率的影响Fig.5 Effects of temperature on protein recovery

2.6 不同时间处理的肌浆蛋白回收率变化

时间对蛋白质回收率的影响如图6所示。随着絮凝时间的延长，蛋白质回收率先呈增加的趋势，在90 min处达到最大值，之后回收率降低。可能的原因是在絮凝初期，壳聚糖与蛋白质未充分螯合并絮凝形成沉淀；而絮凝时间过长，蛋白质回收率有下降趋势，原因可能是絮凝聚集体出现解聚现象。

图6 时间对蛋白质回收率的影响Fig.6 Effects of time on protein recovery

2.7 响应面试验结果与分析

根据单因素试验结果，絮凝时间设定为90 min。分别设pH值(A)、温度(B)、壳聚糖用量(C)共3个考察因素，以蛋白质总回收率(Y)为响应值，进行响应面优化试验，结果见表1。对响应面试验结果进行拟合分析，得回归方程：Y=84.08-1.13A-0.12B+0.24C-0.17AB+1.08AC-0.082BC-0.072B2-0.39C2。

表1 Box-Bechnken 试验设计及结果Table 1 Box-Bechnken design and results

表2 回归方程的方差分析结果Table 2 Analysis of variance of regression model

通过回归方程可知，二次项系数为负值，表明方程具有最大值。根据响应面Design-Expert软件分析得出预测最优条件为：pH 6.5、温度29.45 ℃、壳聚糖用量250 mg/L，预测蛋白质回收率85.72%。

2.8 验证试验结果

根据模型优化结果及实际条件，设置初始pH 6.5、温度30 ℃、壳聚糖用量250 mg/L，时间90 min为絮凝条件，对优化结果进一步进行验证，重复3次试验，取平均值。采用预测的最优试验条件进行试验，得到的实际蛋白质回收率为85.23%，与预测值85.72%吻合较好，表明优化模型可靠。

2.9 COD测定结果

经最优絮凝条件处理后，鱼糜漂洗液COD值为179.98 mg/L，COD去除率达73.32%，剩余26.68%未去除的化学需氧量可能源于残留蛋白、漂洗液中的脂肪、色素和其他有机物。由此可见，酸处理在提高壳聚糖絮凝蛋白效果的同时，也可加大其对鱼糜漂洗液中化学需氧量的去除。

3 讨 论

鱼糜漂洗液中肌浆蛋白等电点集中于5.5左右[23-24]，溶液pH值接近蛋白质等电点时会发生蛋白质等电点沉淀现象，这在一定程度上也提高了蛋白质的回收率。而当溶液pH值较低时，蛋白质带正电，而壳聚糖的氨基在酸性溶液中质子化使壳聚糖带正电，两者的静电排斥效应赋予系统的相对动态稳定性[26]，从而导致回收率较低；一旦超过最适pH时，蛋白质在碱性环境下增溶[27-28]，使其回收率下降。壳聚糖用量也是影响蛋白质回收率的一个重要因素，在絮凝过程中，随着壳聚糖含量增加，壳聚糖与蛋白质能够有效地进行电荷中和、桥连作用和静电相互作用而聚集沉降，并在zeta电位为零时达到最佳的絮凝效果[12]。但壳聚糖用量过多，蛋白质絮凝回收率有下降趋势，据文献报道，壳聚糖在溶液总体呈电中性时出现较高的絮凝度，但溶液偏离电中性导致蛋白质回收率下降[29]。此外，肌浆蛋白的变性温度为40 ℃左右[24]，因此，温度较高会使蛋白质发生热变性，空间结构被破坏而失稳沉淀[30-31]。

为回收鱼糜漂洗废水中的肌浆蛋白从而达到净化水体、提高环境效益的目的，本研究采用盐酸-壳聚糖絮凝耦合处理回收鱼糜漂洗液中肌浆蛋白，以提高壳聚糖的絮凝效率。结果显示：相对于传统壳聚糖絮凝法，盐酸处理可以很好地提高壳聚糖对肌浆蛋白的回收率，其作用原理源于在酸性溶液中壳聚糖质子化带正电荷，具有良好的溶解性，可以与肌浆蛋白充分相容；当pH值升高时，蛋白质分子逐渐解离成电负态，容易迅速与带正电的壳聚糖发生静电吸引而絮凝、沉降下来。与此同时，伴随着蛋白质的等电点沉淀在一定程度上提高了蛋白质的回收率。

陈庆全等[18]选用壳聚糖作为絮凝剂回收罗非鱼鱼糜漂洗液蛋白，在pH 7.0、壳聚糖2.13 mg/mL、温度30 ℃的条件下絮凝90 min，蛋白质回收率47.28%。薛超轶等[19]采用壳聚糖作为絮凝剂回收鱼糜漂洗液蛋白，通过工艺优化所得蛋白质回收率为50.79%。靳挺等[17]采用单一壳聚糖絮凝法获得的蛋白质回收率在40%左右，COD去除率仅为22.73%。齐祥明等[23]采用壳聚糖絮凝回收分级等电沉淀后鱼糜漂洗液中蛋白时，COD总去除率为66.1%。本研究通过单因素试验及Box-Bechnken中心组合设计试验优化蛋白回收工艺，确定鱼糜漂洗液中肌浆蛋白的最佳回收工艺为：pH 6.5、温度30 ℃、壳聚糖用量250 mg/L、时间90 min，此条件下得到的蛋白质回收率为85.23%，同时COD去除率高达73.32%。且此方法引入鱼糜漂洗液中的NaCl质量分数为0.006%，不会增加后续废水处理成本，具有一定的可行性。